摘要
【目的】 明确银粉蔷薇的繁育系统、传粉特性及濒危机制，为珍稀濒危植物的保护和繁育提供理论依据。【方法】采用离体培养萌发法测定花粉活力，联苯胺-过氧化氢法测定柱头可授性，扫描电镜观测其花粉形态，人工观察和记录其花部特征、开花动态和访花昆虫。【结果】(1)银粉蔷薇花粉开花后第4天活力最高，柱头可授性最佳期为开花后第3天。(2)银粉蔷薇单花花期为5~7 d，种群花期为25 d左右，杂交指数(OCI)为4，繁育系统评判为异交型，部分自交亲和，异交需要传粉者。(3)银粉蔷薇传粉昆虫单一，东方蜜蜂和熊蜂为主要传粉者。【结论】银粉蔷薇的繁育机制是异交型，部分自交亲和，为虫媒传粉。传粉昆虫单一，传粉行为易受天气影响和人为干扰是银粉蔷薇濒危的重要原因；在花期释放有效昆虫和减少人为破坏是银粉蔷薇保育的重要措施。
Abstract
[Objective] The study aims to examine the breeding system, pollination characteristics, and endangered mechanism of Rosa anemoniflora, and provide theoretical basis for the protection and breeding of the rare and endangered plants. [Methods] Pollen viability was measured by in vitro culture germination method. Stigma receptivity was measured by benzidine hydrogen peroxide method. Pollen morphology was observed by scanning electron microscope. Flower characteristics, flowering dynamics, and visiting insects were manually recorded and observed. [Results] (1) The pollen vitality of R. anemoniflora was the highest on the fourth day of flowering, and the best period of stigma receptivity was the third day. (2) The single flowering period of R. anemoniflora was 5-7 days, and the population flowering period was about 25 days. The hybridization index (OCI) was 4. The breeding system was heterozygous with partially self-compatible, and outbreeding requires pollinators. (3) R. anemoniflora had a single pollinator, with Apis cerana and Bombus sp. being the main pollinators. [Conclusion] The breeding mechanism of R. anemoniflora was heterozygous, partially self-compatible, and pollinated by insects. The single pollinating insect and the susceptibility of pollination behavior to weather conditions and human interference were important reasons for the endangerment of R. anemoniflora. Releasing effective insects during the flowering period and reducing human damage were important measures for the conservation of R. anemoniflora.
繁殖是植物生活史的关键阶段和种群维持与更新的重要环节，野生植物种群繁殖能力的衰退是导致其濒临灭绝的重要原因[1-2]。植物繁育系统是指后代遗传组成的所有有性特征，包括花综合特征、花各性器官的寿命、花开放式样、自交亲和程度和交配系统等[3]。研究表明，由于野外状态下自然生境的破坏和片段化经常导致传粉者的数量和种类减少，并改变了传粉者的觅食行为，限制了在不同斑块间的活动[4-5]。这些因素减少了濒危植物所能接受的昆虫访花频率，致使所获得的花粉较少且质量较低，从而受到花粉限制并降低繁殖成功率，影响种子质量[6]。探明濒危植物的繁殖限制可促进对其有效保护，因此繁殖生物学成为近年来植物保护生物学的研究重点，尤其对濒危植物和珍贵物种的保育具有极为重要的意义。
蔷薇属（Rosa）植物在世界范围内分布有近200种，仅中国就有95种，是月季育种的重要资源库[7]。已有研究表明，蔷薇属植物具有复杂的繁育系统，包含异株异花授粉、同株异花授粉、无融合生殖、促进（被动）自花授粉和主动自花授粉5种，并且多数植物具有异交和自交2种繁育系统[8]。伍翔宇等[9]研究中甸刺玫和川滇蔷薇时发现，蔷薇属植物繁育系统和传粉机制较为复杂，且种间差异大。因此，有研究认为，蔷薇属植物种子普遍存在的质量不高和传播力弱等现象可能与其复杂的繁育系统和传粉机制有关[10]。目前有关蔷薇属繁育系统和传粉机制的研究多集中在栽培种上[11-14]，野生种特别是濒危野生种的繁育系统和传粉机制鲜有报道，而这可能是导致其濒危的重要原因。可见，开展濒危蔷薇属植物的繁殖系统和传粉机制研究对该属植物的保护和扩繁意义重大。
银粉蔷薇（R. anemoniflora）是蔷薇属（Rosa）攀援小灌木，该种群目前呈斑块状分布，其野外生境已严重片段化，处于严重隔离状态。截至目前，国内仅在福建省南平市少部分地区有发现，野外存活数量少，属于典型极小种群，2021年已被《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》（IUCN）列入近危（NT）[15]，被中国《国家重点保护野生植物名录》收录为国家二级保护植物[16]。已有研究表明，银粉蔷薇叶功能性状多样性丰富，并可通过叶功能性状变异和组合适应海拔变化和异质生境[17]。可见，导致银粉蔷薇濒危的原因可能是繁育系统和传粉限制而并非生境限制。鉴于此，本课题组开展了银粉蔷薇的开花生物学特性与繁育系统研究，以期探明银粉蔷薇的繁育机制，并从生殖生物学角度揭示其濒危原因。研究结果可为蔷薇属植物的保护和繁育提供理论参考。
1 材料和方法
1.1 研究区域概况
研究区位于福建省南平市延平区茫荡镇谢地村，地处福建茫荡山国家级自然保护区内（118°4′19.04″E，26°41′2.45″N），海拔约800 m。该区域为中亚热带季风气候，年平均气温19.3℃，极端最高气温41℃，极端最低气温-5.8℃，年均降水量1 616.1 mm，常年相对湿度78%，年均日照时间1 733.3 h，年平均霜期为69.8 d。整个种群有银粉蔷薇450余株，主要分布在路边灌丛中，其群落主要优势树种为马银花（Rhododendron ovatum）、映山红（Rhododendron simsii）、檵木（Loropetalum chinense）、苦竹（Pleioblastus amarus）等；伴生植物为五节芒（Miscanthus floridulus）、狗脊（Woodwardia japonica）、荔枝草（Salvia plebeia）、野茼蒿（Crassocephalum crepidioides）、败酱（Patrinia scabiosifolia）、菝葜（Smilax china）等草本植物。
1.2 研究方法
1.2.1 花部形态特征观察
选取20株处于盛花期的植株，每株采集10朵花，用游标卡尺测量花冠口直径及花瓣、花丝、花药、雌蕊、花柱、花序、花萼的长度和宽度。按照Dafni[18]的方法计算杂交指数（OCI）：（1）雄蕊先熟记为1，雌蕊后熟或柱头具可授性和花药开裂时间一致记为0；（2）花冠直径＞6 mm记为3，2~6 mm记为2，1~2 mm记为1，0~1 mm记为0；（3）花药与柱头不同高度记为1，同一高度记为0。以上三者之和为OCI值。
1.2.2 开花生物学观察
选择30朵花蕾期的花，对其挂牌标记，连续观测其开花过程，观察各部分的颜色、形状、数量、气味和花蜜的有无，直至花朵枯萎脱落。记录花朵开放、花粉释放、柱头伸出的时间，观察单花花期和种群花期。
1.2.3 花粉活力测定
选取30朵不同植株的花，从花蕾期开始采用离体培养萌发法[19]测定花粉活性，每天测定1次，每组重复3次。分别用浓度为5%、10%、15%的蔗糖溶液，0.025 g/L的硼酸溶液和1%的琼脂为培养基固化剂，在24℃下培养4 h后测定花粉活性，记录花粉数量和花粉萌发率。为避免测定方法对花粉活性的影响，同时采用红墨水法、TTC（2，3，5-三苯基氯化四氮唑）法和I2-KI法3种方法进行花粉活性的比较测定[20]。
1.2.4 柱头可授性检测
用联苯胺-过氧化氢法测定柱头可授性[21]，将不同开花时间的柱头分别浸泡在联苯胺-过氧化氢反应液中，记录反应液变化以判断柱头是否具有可授性。
1.2.5 访花者及访花频率观察
选取30丛盛花期植株，连续3 d进行观察记录[22]，观察时间为8:00-18:00，以1 h为时间段对访花昆虫进行观察并记录昆虫的访花过程，包括时间、停留时长、数量和行为等，然后计算访花频率，并捕捉昆虫制作标本进行种类鉴定。平均访花频率为不同时间段访花频率的平均数。访花频率为访花次数与观察时间之比。
1.2.6 数据处理
用Excel 2016和Origin 8.5统计数据和绘制图表。用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），比较不同处理下的花粉萌发率是否存在差异。
2 结果与分析
2.1 开花生物学特性
2.1.1 花部形态特征
银粉蔷薇花期在4月中旬至5月中下旬，种群花期可持续25 d左右，单花花期为5~7 d。花单生或呈伞房花序，花粉红色，完全花，有芳香味，花两性。花梗和花序梗均直立或斜出。萼片5，萼片披针形，先端渐尖，全缘，长（15.04±1.34）mm，宽（3.70±0.43）mm；花瓣卵形，长（21.20±3.04）mm，宽（21.20±3.04）mm；雄蕊多数，分为数轮，花丝长（4.99±1.46）mm，花药长（0.98±0.18）mm，花药纵裂、基着药；心皮多数，花柱结合成束，花柱长（6.30±1.53）mm，线性（图1）。按照Dafni的标准，银粉蔷薇花冠口直径为（43.55±5.63）mm，记为3；花为两性花，柱头具可授性和花药开裂时间一致，记为0；雌雄蕊在空间上分离，柱头略高于花药，记为1；统计结果显示，银粉蔷薇的杂交指数≥4。根据繁育系统评判，银粉蔷薇为异交型，部分自交亲和，其柱头略高于花药，异交需要传粉者。
图1银粉蔷薇生境、花序、花部结构、花药、柱头及子房形态
Fig.1Habitat, inflorescences, anthers, stigmas, and morphology of ovaries of R. anemoniflora
A.生境；B.花序；C.花；D.花部结构；E.花药开裂方式；F.花药着生方式；G.合生柱头；H.子房。
A. Habitat. B. Inflorescences. C. Flowers. D. Flower structure. E. Anther dehiscence mode. F. Anther insertion mode. G. Synaptic stigma. H. Ovary.
通过扫描电镜观察，银粉蔷薇的花粉为单粒花粉，呈圆球形，无刺。单粒花粉直径40.56 μm，平均直径43.42 μm；极面观圆形，具3个单孔沟，孔沟未达极面观顶点，沟长14.02~19.56 μm；沟宽2.41~4.23 μm。
赤道面观椭球形，花粉萌发孔在孔沟中部，萌发孔长4.65 μm，宽2.44 μm；孔沟边缘呈加厚，沟内内含物外露，孔沟周围颗粒细密呈波状突起，与外壁纹饰区别明显。表面纹饰条纹状，条纹中有少量细孔分布（图2）。
2.1.2 开花物候
银粉蔷薇单花花期5~7 d，晴天温度较高花期较短，约为5 d，阴雨天温度较低花期较长，约为7 d。其花期主要分为5个阶段（图3），分别为花蕾期：花蕾呈黄绿色，花萼紧紧包裹住花瓣，花瓣未开放，雄蕊包围雌蕊，花药膨大围绕在花柱周边；初开期：花瓣呈玫红色，未完全展开，柱头呈白色，略高出花药部分，距离柱头较近的花药呈金黄色，未散粉，离花柱较远的雄蕊仍未开裂；盛花期：玫红色花瓣完全展开，柱头呈白色，距离花柱较近的花药开始散出花粉，散粉后花药变得干瘪且发黑，距离花柱较远的部分花药依然未散粉，呈淡黄色；衰落期：此时柱头颜色加深，呈黄色，花药围绕花柱紧密排列，已全部开裂，呈黄色，花粉散出，并萎缩；凋谢期：花瓣枯萎皱缩，花药萎缩，花粉基本散尽，柱头与花药的颜色加深，呈褐色，最后花瓣和花药一起脱落。
图2银粉蔷薇花粉形态
Fig.2Pollen morphology of R. anemoniflora
A.极面观；B.赤道面观；C.表面纹饰。
A. Polar view. B. Equatorial view. C. Exine ornament.
图3银粉蔷薇开花动态
Fig.3Flowering dynamics of R. anemoniflora
A-B.花蕾期；C.初开期；D.盛花期；E.衰落期；F-G.凋谢期。
A-B. Stamen stage. C. Initial opening stage. D. Blooming stage. E. Declining stage. F-G. Withering stage.
2.2 繁育系统特征
2.2.1 花粉活力
采用不同方法测定银粉蔷薇花粉活力，红墨水染色法效果最好，有无活力花粉颜色差异较大，易于区分，其次为TTC法，而I2-KI法效果较差（图4）。在7 d培养时间内，银粉蔷薇花粉活力先升高后下降，第1天活力较低（41.23%），第2-4天活力最高（均为80%以上），第5天后（40.51%）花粉活力显著降低，第7天基本丧失（仅为11.03%）。
用5%的蔗糖溶液进行银粉蔷薇花粉离体培养效果最佳，其花粉萌发率为65.77%，显著高于浓度为10%（46.31%）和15%（52.51%）的蔗糖溶液。
图4不同方法测定花粉活力及不同蔗糖浓度下花粉管萌发情况
Fig.4Different methods for measuring pollen vitality and pollen tube germination at different sucrose concentrations
A.红墨水；B.TTC；C.I2-KI；D.5%蔗糖+0.025 g/L硼酸；E.10%蔗糖+0.025 g/L硼酸；F.15%蔗糖+0.025 g/L硼酸。
A. Red ink. B. TTC. C. I2-KI. D.5% sucrose+0.025 g/L boric acid. E.10% sucrose+0.025 g/L boric acid. F.15% sucrose+0.025 g/L boric acid.
2.2.2 柱头可授性
银粉蔷薇开花第1-2天柱头部分具有可授性，开花第3天柱头可授性最高，第4天柱头具有可授性，第5天柱头可授性较低，第6天不具可授性。
2.3 访花昆虫及访花行为
野外观察发现，银粉蔷薇的访花昆虫有4目5科6种（图5），主要访花昆虫有东方蜜蜂（Apis cerana）、熊蜂（Bombus sp.）、食蚜蝇（Scaeva pyrastri）、黑带食蚜蝇（Episyrphus balteatus）、红头芜菁（Epicauta ruficeps）和螽斯（Longhorned grasshoppers）。东方蜜蜂体型较小，在访花过程中声音较大，振幅较强，停留时间最长，停留10~14 s，通常在同一植株连续访问几朵花后离开，采集花粉时身体弯曲，用前足紧紧抱住花朵，从花冠正上方开口处进入花内，在花内环绕雄蕊采集花粉。
图5访花昆虫
Fig.5Flower-visiting insects
A.东方蜜蜂；B.黑带食蚜蝇；C.食蚜蝇；D.熊蜂；E.红头芜菁；F.螽斯。
A. Apis cerana. B. Episyrphus balteatus. C. Scaeva pyrastri. D. Bombus sp.. E. Epicauta ruficeps. F. Longhorned grasshoppers.
熊蜂体型较大且被稠密绒毛，携粉量大，声音最大，振幅最强，访花时间短且次数少，一般集中于早晨进行采集，单花停留时间3~5 s，访花时，直接落于花上，用喙吸取花蜜，身体弓起，前足直接落于雄蕊上，足部和胸部沾满花粉。其他昆虫总体体型较小，在访花过程中声音较小，振幅较弱，访花次数较少。采集花粉时通常将身体紧弓，用前足抱住花朵，常置于一点进行采集，与柱头接触较少。总体而言，东方蜜蜂和熊蜂为有效传粉者，其他的为无效传粉者。
从访问频率来看，以东方蜜蜂的访问频率最高，熊峰、食蚜蝇、黑带食蚜蝇次之，红头芜菁和螽斯平均访花频率最低。图6表明，昆虫的访花频率在一天之中存在显著差异，8:00-10:00和14:00-16:00昆虫访问频率最高，且停留时间最长；12:00-13:00昆虫访问率最低，停留时间最短。
图7表明，访花昆虫的停留时间与温度呈负相关（P＞0.05），在一定温度区间内，温度越高停留时间越短，反之，温度越低停留时间越长；停留时间和湿度呈正相关（P＞0.05），湿度越高停留时间越长，反之，湿度越高停留时间越短。
图6不同时间段昆虫访花频率及停留时间
Fig.6Insect visiting frequency and residence time at different periods
图7温度和湿度与昆虫停留时间的关系
Fig.7The relationship between temperature, humidity, and insect residence time
3 讨论
3.1 开花物候对银粉蔷薇传粉生殖的影响
植物开花表型诸如花朵数量、开花时间和开花时长等是影响植物繁殖成功率的重要原因[23]。植物开花时间不仅受种群本身遗传特征的影响，而且与所处环境条件密切相关[24]。研究发现，在不利条件下，植物会延长花期来保证昆虫的授粉时间[25-27]。物候观察发现，银粉蔷薇开花量大，单花花期为5~7 d，同步性较高，种群花期为25 d。花期多处于南方梅雨季节，花瓣易受短时强降雨等破坏而掉落、花粉被冲刷，花药因湿度大而腐烂等不良现象，从而影响传粉的成功率，这种有性繁殖限制与细果秤锤树[28]一致。
已有研究表明低温会对植物花粉活性有一定程度的抑制作用[29-30]，这可能是影响部分植物传粉困难的原因之一。银粉蔷薇虽地处中高海拔地区，总体气温偏低，但花粉活力总体较高，第2-4天花粉活力均在80%以上，比大多数蔷薇属植物的花粉活力（60%以下，仅金樱子81.17%）都高[31]，因此，花粉活力不是造成银粉蔷薇濒危的原因。
3.2 花部形态与传粉方式对银粉蔷薇传粉生殖的影响
花的颜色、形状和气味是植物吸引昆虫的重要条件[32]。一般来说，花色鲜艳、花香明显的植物能较好地吸引昆虫[33-34]。本研究中，银粉蔷薇花单生或呈伞房花序，花大且数量多，同步性较高，开花时呈粉红色，有明显花香，能有效吸引昆虫，其开花前期花瓣和花药颜色鲜艳，花香明显，吸引昆虫传粉，传粉完成后，颜色变浅且花香变淡，可有效提高昆虫识别率，且柱头可授性和花粉活力持续时间长，确保了花粉传粉时间和柱头授粉效率，表现出对异花传粉的高度适应性。Lynn等[35]研究发现花粉表面刺的大小和形态可显著提高花粉的附着力。本研究发现，银粉蔷薇花粉表面无刺，花粉不易附着，掉落几率高，这可能在一定程度上导致其传粉成功率较低。
一般来说，雌雄异熟、雌雄异位和自交不亲和被认为是促进和避免近亲繁殖的重要机制[36]。为了满足生存需要，生物体往往会制定一套必要的繁殖补偿机制，以确保物种的顺利繁殖[37]。本研究发现，银粉蔷薇为异交型，需要传粉者，其虫媒传粉型对传粉昆虫依赖度高，而昆虫传粉受天气和温度的影响较大，不利的天气条件将会影响昆虫的传粉效率。郭凤霞等[38]对暗紫贝母研究时发现雌雄蕊空间异位大大降低了自交的可能性（低于30%）。本研究中，银粉蔷薇部分自交亲和，虽提供了繁殖补偿机制（异交），但银粉蔷薇雌蕊高于雄蕊，属于典型的雌雄异位，这可能进一步降低了其传粉成功率。
3.3 访花昆虫行为对银粉蔷薇传粉生殖的影响
开花植物的传粉效率与传粉者-植物的互作关系有着密切联系，一定程度制约着植物种群的变化[39-40]。传粉昆虫的访花行为是影响植物传粉成功的重要因素。访花昆虫在运输花粉途中容易导致花粉损失[41-42]。本研究中，银粉蔷薇的传粉昆虫单一，以东方蜜蜂和熊蜂为主，蜂类访花群体较为广泛，在运输花粉时会导致大量花粉损失，导致异交率下降。在野外调查时发现，银粉蔷薇晴天访花者较多，停留时间长，但阴雨天气访花者较少或无，银粉蔷薇自然分布多处于海拔较高的区域，气候低温多雨，大大限制了传粉效率。
已有研究表明，物种组成丰富的群落能在不同时期给昆虫提供稳定的蜜源，能保证传粉昆虫的种类和数量[43-44]。本研究中，银粉蔷薇群落多生长于毛竹林或路边，物种单一，无法提供较为稳定的蜜源，且银粉蔷薇花期多在毛竹出笋期和抚育期，高强度集约经营造成的人为干扰严重，导致生境破坏，并影响了昆虫的稳定传粉，造成传粉昆虫少且成功率低，这可能是影响其授粉失败的又一重要因素。此外，也有研究指出，不同传粉昆虫之间的竞争会造成传粉效率降低[45-46]。实地调查发现，银粉蔷薇的种群片段化严重，一些密度较低的种群会引起传粉者之间的竞争，导致花粉受到限制，当种群密度过高，授粉者种类过于单一，很难确保每朵花都能成功授粉，从而导致授粉不良、部分胚珠败育，影响其生长、繁殖和结果。
4 结论
（1）银粉蔷薇总体花期较长，且花粉活力较高，柱头可授性最佳期为开花后第3天，因此花粉活力不是造成其濒危的主要原因。
（2）银粉蔷薇花粉呈圆球形，无刺，花粉不易附着，掉落几率高，可能降低其传粉成功率。
（3）银粉蔷薇繁育系统为异交型、部分自交亲和，自交率低，过于依赖异交，且其雌蕊高于雄蕊，属于典型的雌雄异位，可能进一步降低了其传粉成功率。
（4）银粉蔷薇的传粉昆虫单一，且受环境和人为干扰因素影响较大，传粉难度大。在开展银粉蔷薇保育和扩繁时，在花期释放有效昆虫并降低人为干扰可以增加自然条件下的异交成功率。
