摘要
【目的】基于磷酸化组学分析干旱胁迫下四倍体香圆叶片蛋白质磷酸化水平的表达规律,以期在分子水平揭示香圆对干旱的响应机制,为后续改良耐旱柑橘砧木品种提供理论依据。【方法】用IMAC亲和富集及 TMT 标记结合技术鉴定和分析四倍体香圆干旱胁迫后的磷酸化蛋白质,并进行功能注释和代谢通路分析。【结果】(1)共有3794个磷酸化位点和1521个磷酸化蛋白质被定量,变化倍数超过1.3倍的磷酸化蛋白质有662个(αFC > 1.3),主要定位在细胞核(46.07%)与叶绿体(24.62%)中;(2)差异表达的磷酸化蛋白质主要通过结合 RNA 和 Ca2+ 发挥功能;同时也参与 RNA 剪接、光合作用、囊泡运输中的SNARE相互作用等代谢通路;(3)92.86%差异表达的磷酸化蛋白质的基因在转录水平和蛋白水平表达变化趋势一致,其 Pearson相关系数为0.893。【结论】四倍体香圆通过磷酸化修饰 RNA 剪接和光合作用等通路中的蛋白质来响应干旱胁迫。
Abstract
[Objective] Using phosphoproteomics, expression patterns of the phosphorylated proteins were analyzed with tetraploid Citrus wilsonii leaves under drought stress, aiming to reveal the mechanism of tetraploid C. wilsonii in response to drought stress and provide support for the improvement of drought-tolerant citrus rootstock varieties. [Methods] Phosphorylated proteins in the leaves of tetraploid C. wilsonii after drought stress were identified and analyzed using IMAC affinity enrichment and TMT labeling technology. Functional annotation and metabolic pathway analysis were performed for the differentially expressed phosphorylated proteins. [Results] (1) A total of 3794 phosphorylation sites and 1521 phosphorylated proteins were quantified. There were 662 phosphorylated proteins with a fold change exceeding 1.3 (αFC>1.3), which were mainly located in the nucleus (46.07%) and chloroplasts (24.62%). (2) The differentially expressed phosphorylated proteins were mainly involved in binding RNA and Ca2+, and participating in metabolic pathways such as RNA splicing, photosynthesis, and SNARE interaction in vesicle transport. (3) RT-qPCR results showed that 92.86% of the genes coding the differentially expressed phosphorylated proteins showed similar trend of change in transcriptional and protein levels with the Pearson correlation coefficient of 0.893. [Conclusion] Tetraploid C. wilsonii regulates the proteins involved in RNA splicing and photosynthesis pathway through phosphorylation in response to drought stress.
Keywords
植物在生长发育过程中,通常会面临干旱、高温、低温和盐碱等非生物胁迫,其中干旱是植物面临的最主要胁迫因素之一。据统计,自20世纪90年代末以来,中国干旱受灾面积逐渐增加,占农作物播种面积的9.0%以上[1]。由于大部分果树,尤其是柑橘多种植于山地、丘陵地区,季节性干旱和不利的浇灌条件极大程度地限制着柑橘生长[2],从而引起其表型、生理生化和基因表达等多层次的变化,严重时甚至导致光合作用终止和代谢紊乱,最终导致柑橘死亡。因此,研究作物的抗旱机理,提高植物的耐旱性对干旱地区农林业发展极其重要。香圆(Citrus wilsonii Tanaka),又名枳雀,芸香科,柑橘亚科,柑橘属,是陕南地区特色柑橘栽培品种,常用作嫁接砧木,已有研究证实香圆与其他柑橘类砧木相比具有较强抗逆性。Fu等[3]发现,在钙质土壤条件下,香圆相比于枳砧具有显著的抗缺铁黄化效果。进一步研究表明,香圆砧木对缺铁的耐受性可能与细胞壁修饰和乙烯、脱落酸(ABA)信号通路有关[4]。此外,已有研究表明多倍体柑橘砧木相比于二倍体对非生物胁迫更具耐受性,包括干旱[5-6]、低温[7]、高温[8]、盐[9]和铬毒性[10]等。Wei等[5]在探究干旱胁迫对四倍体和二倍体枳(Poncirus trifoliata)的影响中发现,四倍体枳的抗旱性显著高于二倍体。Jiang 等[11]通过对筛选的四倍体香圆进行干旱胁迫处理,发现与二倍体香圆相比,四倍体香圆通过协同调节光合作用、植物激素的积累和磷酸化修饰来增强其抗旱性,但具体的磷酸化表达规律尚不清楚。
蛋白质翻译后修饰主要包括磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化等,其中磷酸化是最常见且研究最深入的修饰方式[12]。蛋白质磷酸化是通过蛋白激酶催化将 ATP的磷酸基团转移到底物蛋白质的氨基酸残基上,如丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr),或者在信号作用下与 GTP 结合[13],以此调节蛋白质的活性、稳定性以及蛋白间的相互作用,在众多信号转导途径中发挥关键作用,是植物响应环境胁迫信号的重要机制[14]。蛋白质磷酸化修饰在真核生物中普遍存在,除 Ser、Thr和 Tyr3种可以发生磷酸化修饰的经典氨基酸外,组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)及谷氨酸(Glu)也能发生磷酸化修饰,并且广泛参与调控植物的生长、发育、衰老、死亡、信号转导以及各种疾病的发生与发展过程[15]。袁峥等[16]通过蛋白质组学分析发现硫氧还蛋白参与冬青卫矛(Euonymus japonicus)抗旱和抗氧化胁迫等多个过程。Zhang 等[17]研究干旱胁迫下丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)叶片的翻译后修饰分子机制发现,在重度干旱时,磷酸化蛋白主要参与蛋白质加工、光合作用、 RNA 结合和剪接相关的生物过程。因此,本文利用 IMAC亲和富集和 TMT 标记结合的比较磷酸化组学技术,分析干旱胁迫后四倍体香圆的磷酸化修饰蛋白表达图谱的变化,并对差异表达的磷酸化蛋白质进行功能富集分析,筛选与干旱相关的蛋白质以及参与的主要代谢通路,以期在分子水平揭示四倍体香圆对干旱胁迫的响应机理。
1 材料和方法
1.1 试验材料
2020年12月下旬从汉中市城固县陕南柑橘综合试验站采集香圆果实。从果实中剥出成熟的种子,用0.5mol/L的 NaOH 溶液浸泡10~15min,蒸馏水洗净后,用0.2mol/L的次氯酸钠溶液消毒,种子沥出用无菌水清洗3次后转移至垫有湿滤纸的培养皿中,28℃培养箱催芽,待种子发芽后移至按照一定体积比混合的营养土(泥炭土∶蛭石=3∶1)中继续培养,培养条件为光照强度4000lx,16h光照/8h黑暗,温度(25±2)℃,湿度50%~60%。参照周锐等[18]的方法,通过多倍体的形态学特征初步筛选出疑似的四倍体香圆,并根据根尖染色体压片法对疑似四倍体进行鉴定,最终获得1批四倍体香圆植株。
1.2 干旱胁迫处理
四倍体香圆在植物光照培养间进行培养,长至 6~9片真叶时进行干旱胁迫处理。处理组以停止浇水3d后开始计时; 对照组每3d早上9:00浇水,每种处理设置3组生物学重复。控水处理21d后分别对对照组和处理组叶片取样,将样品迅速置于液氮中速冻,-80℃冰箱保存备用。
1.3 磷酸化组学分析
采集干旱处理组和对照组的四倍体香圆叶片组织(100mg)进行磷酸化蛋白质组学分析,磷酸化蛋白质组学分析由 PTM BIO 公司(中国杭州)完成。干旱胁迫组(TD)和对照组(TC)分别设置 3 组重复,使用固定化金属离子亲和层析(IMAC)树脂富集磷酸肽,TMT 技术标记磷酸化肽段。
1.4 数据库搜索
用 Proteome Discoverer(v2.4.1.15)检索2级质谱数据。数据库为 Blast Citrus sinensis 2711 Poncirus trifoliata 37690 CPBD 20211022 fasta(89242条序列); 酶切技术调整至 Trypsin(Full),漏切位点数调整至2,氨基酸残基最小长度调整为6 个,肽段的最大修饰数调至3。将Carbamidomethyl(C),TMT-6plex(peptide N-Terminus),TMT-6plex(K)设置为固定修饰。定量方法设置为 TMT-6plex,蛋白、肽段和 PSM 鉴定的 FDR为1%。
1.5 生物信息学分析及数据处理
用 WolF Psort软件对所提交的蛋白进行亚细胞定位分析; 用基于 Motif-X 算法的 MoMo分析工具,分析磷酸化修饰位点的基序特征; 用 Excel 2021、SPSS 27、GraphPad Prism 9.0软件对所得数据进行统计分析和制图。
1.6 RT-qPCR扩增分析
根据磷酸化蛋白质组的鉴定结果,进入 CPBD 数据库查找各磷酸化蛋白的 CDS序列,用 Primer 5.0设计引物。用艾科瑞 SYBR Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒配制 PCR 反应液,RT-qPCR 反应在Step One Plus Real Time PCR System 上完成,扩增反应程序采用两步法进行,反应程序为:预变性94℃,2min; 变性94℃,15s; 退火—延伸60℃,30s,40个循环,融解曲线为机器默认值。每个处理设置3组重复,14个基因的相对表达量用法计算。基因和蛋白的相对表达量均为log2αFC 转换后的数据,其中αFC 表示四倍体香圆干旱胁迫组基因或蛋白的表达量相较于对照组基因或蛋白的表达量的倍数。
2 结果与分析
2.1 磷酸化蛋白质鉴定与定量分析
结果显示,共鉴定出8756个磷酸化位点和3652 个磷酸化蛋白质,其中有3794个位点和1521个蛋白质被量化(图1,A)。
图1干旱胁迫下四倍体香圆叶片中鉴定的磷酸化蛋白质和磷酸化位点分布
Fig.1Distribution of the phosphorylated proteins and phosphorylation sites identified in tetraploid C. wilsonii leaves under drought stress
A.鉴定磷酸化蛋白质及位点;B.丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和酪氨酸(Y)残基磷酸化修饰的分布情况; C.差异磷酸化蛋白质数目;D.差异磷酸化位点数目。
A. Identified phosphorylated proteins and sites. B. Distribution of phosphorylation modifications on serine (S) , threonine (T) , and tyrosine (Y) residues. C. Number of the differentially phosphorylated proteins. D. Number of the differentially phosphorylated sites.
在8756个磷酸化修饰位点中Ser残基占86.30%(7556个),Thr残基占13.35%(1169个),Tyr残基占0.35%(31个)(图1,B)。用差异倍数以及统计学方法t 检验,筛选差异表达的磷酸化蛋白质(αFC>1.3且P<0.05时作为显著上调的阈值,αFC <1/1.3且P<0.05时作为显著下调的阈值)。参照以上标准,在干旱胁迫下,有301个被磷酸化的蛋白质表达显著上调,361个被磷酸化的蛋白质表达显著下调(图1,C),同时鉴定到971个显著差异的磷酸化修饰位点(图1,D)。
2.2 差异表达的磷酸化蛋白质亚细胞定位分析及 Motif修饰分析
对干旱胁迫后662个差异表达的磷酸化蛋白质进行亚细胞定位分析。如表1所示,305个差异表达的磷酸化蛋白质定位在细胞核中发挥调控作用,163个差异磷酸化蛋白质定位在叶绿体中参与光合作用。此外,定位在细胞质、质膜和线粒体中的差异磷酸化蛋白质分别为86,66,22个。
基于 Motif-X 算法的 MoMo分析工具,采用热图展现了修饰位点附近氨基酸出现的频率。结果显示,精氨酸(R)、脯氨酸(P)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)和天冬氨酸(D)在磷酸化 Ser位点周围有明显的偏好性(图2,A),精氨酸(R)和脯氨酸(P)在磷酸化 Thr位点周围出现的频率较高(图2,B)。利用 Motif-X程序对鉴定到的7702个磷酸化 Ser/Thr周围的氨基酸残基进行统计,其中以 Thr为中心的磷酸化肽段有773条,共鉴定到9种类型的基序(图2,C); 以Ser为中心的磷酸化肽段有6929条,共鉴定到50种类型的基序(图2,D)。
表1干旱胁迫下四倍体香圆差异表达的磷酸化蛋白质的亚细胞定位分布
Table1Subcellular distribution of the differentially phosphorylated proteins in tetraploid C. wilsonii under drought stress
图2干旱胁迫下四倍体香圆叶片中差异表达的磷酸化蛋白质修饰位点基序分析
Fig.2Motif analysis of modification sites of the differentially expressed phosphorylated proteins in tetraploid C. wilsonii leaves under drought stress
A.Ser(S)修饰位点附近氨基酸出现频率;B.Thr(T)修饰位点附近氨基酸出现频率;C.以Thr为中心的基序;D.以Ser为中心的基序。
A. Frequency of amino acid occurrence near the serine (S) modification site. B. Frequency of amino acid occurrence near the threonine (T) modification site. C. A motif centered on Thr. D. A motif centered on Ser.
2.3 差异表达的磷酸化蛋白质功能分析
根据磷酸化组学数据,对662个差异表达的磷酸化蛋白质进行 GO 注释。如表2所示,在细胞组分中,差异表达的磷酸化蛋白质主要富集在亚细胞器、质体类囊体膜、光合作用膜中; 在分子功能中,差异表达的磷酸化蛋白质主要结合 mRNA、Ca2+ 以及 SNARE发挥功能; 在生物学过程中,差异表达的磷酸化蛋白质涉及囊泡转运、细胞成熟、胞外分泌等过程。
表2差异表达的磷酸化蛋白质的 GO富集分析
Table2GO enrichment analysis of the differentially expressed phosphorylated proteins
对干旱胁迫后四倍体香圆差异表达的磷酸化蛋白质进行 KEGG 通路分析发现,21个差异表达的磷酸化蛋白质上调,27个差异表达的磷酸化蛋白质下调。如图3所示,上调的差异表达磷酸化蛋白质参与 RNA 降解、囊泡运输中的 SNARE 相互作用以及吞噬体的吞噬作用,而下调的差异表达磷酸化蛋白质富集在光合作用通路上,同时也参与 RNA 剪接。结果表明,在光合作用及 RNA 降解途径中关键蛋白的磷酸化在四倍体香圆响应干旱胁迫过程中发挥重要作用。
差异表达的磷酸化蛋白质结构域分析结果显示,上调的差异表达磷酸化蛋白质含有阳离子转运体/ATP 酶、卤代酸脱卤酶类水解酶、调节型SNARE 结构域、微管蛋白/FtsZ家族 GTPase结构域、微管蛋白 C 端结构域、Plectin/S10结构域、磷酸甘油酸激酶、PB1结构域、C2结构域等; 下调的差异表达磷酸化蛋白质含有Sec7结构域、RNA 识别基序、甲基转移酶结构域、M41肽酶家族、锌指结构域等(表3)。
图3差异表达的磷酸化蛋白质的 KEGG富集分析
Fig.3KEGG enrichment analysis of the differentially expressed phosphorylated proteins
表3差异表达的磷酸化蛋白质的结构域分析
Table3Domain analysis of the differentially expressed phosphorylated proteins
2.4 差异表达的磷酸化蛋白质互作网络分析
将筛选得到的差异表达的磷酸化蛋白质与 STRING(v.11.0)蛋白互作网络数据库比对,按照置信度得分(confidence score)>0.7(高置信度,high confidence)提取,得到差异表达的磷酸化蛋白质互作关系,将结果进行可视化展示,筛选前50个互作关系最紧密的差异表达的磷酸化蛋白质,绘制蛋白互作网络图。结果(图4)显示,编号 Cs_ont_2g015710.1和Cs_ont_5g020610.1各有13对互作关系; 编号 Cs_ont_3g009920.1、Pt4g002880.1和 Cs_ont_1g021520.1各有11对互作关系; 编号 Cs_ont_9g018580.1、Pt6g007560.1和 Cs_ont_5g008140.1 各有10对互作关系; 编号 Cs_ont_5g042960.1 和 Cs_ont_6g008320.1各有6对互作关系。
图4蛋白质-蛋白质互作网络(PPI)
Fig.4Network of protein-protein interactions (PPI)
图中圆圈表示磷酸化修饰的蛋白质,绿色为下调蛋白,红色为上调蛋白,颜色越深,代表差异倍数越大。
Circles in the figure represent the differentially phosphorylated proteins, with green representing downregulated proteins and red representing upregulated proteins. The darker the color, the greater the fold change.
2.5 差异表达的磷酸化蛋白质在转录水平的分析
通过 RT-qPCR 技术检测差异表达的磷酸化蛋白对应基因在转录水平的相对表达量(图5中数据均已做对数转换)。结果表明,92.86%的差异表达的磷酸化蛋白质对应基因在转录水平和蛋白质表达水平趋势一致(图5,A),且有较高相关性,Pearson 相关系数为0.893,P<0.01(图5,B)。结果表明,差异表达的磷酸化蛋白在转录水平也发生了显著变化。
图5差异表达的磷酸化蛋白质在转录水平的分析
Fig.5Analysis of the differentially expressed phosphorylated proteins at the transcriptional level
A.部分差异表达的磷酸化蛋白相对表达量及其相应基因相对表达量;B.差异表达的磷酸化蛋白水平与转录水平相关性。图A中1-14编号依次表示Cs_ont_8g024700.1、Cs_ont_4g025810.1、 Cs_ont_9g028070.1、PtUn033130.1、Cs_ont_3g028510.1、 Cs_ont_7g013870.1、Cs_ont_1g020850.1、Pt2g001700.1、 Cs_ont_7g009920.1、Pt6g012820.2、Pt3g037190.1、 Pt1g021390.1、Cs_ont_1g026880.1、Cs_ont_8g026740.1。
A. Relative expression of some differential expressed phosphorylated proteins and relative expression of corresponding genes. B. Correlation between expression levels of the differentially expressed phosphorylated proteins and transcriptional level.The number from 1 to 14 in figure A indicate in order: Cs_ont_8g024700.1, Cs_ont_4g025810.1, Cs_ont_9g028070.1, PtUn033130.1, Cs_ont_3g028510.1, Cs_ont_7g013870.1, Cs_ont_1g020850.1, Pt2g001700.1, Cs_ont_7g009920.1, Pt6g012820.2, Pt3g037190.1, Pt1g021390.1, Cs_ont_1g026880.1, Cs_ont_8g026740.1.
3 讨论
对四倍体香圆干旱胁迫后的磷酸化修饰位点分析发现,Ser 残基修饰比例最高为 86.30%,其次 Thr残基占13.35%,Tyr残基占0.35%,这与之前研究中报道过的水稻(Oryza sativa L.)[19]、拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)[20]、棉花(Gossypium hirsutum L.)[21]等结果相似,虽然 Ser和 Thr发生磷酸化的比例高于 Tyr,但 Tyr一旦发生磷酸化,其修饰程度往往比前两者更加稳定[22],表明四倍体香圆的磷酸化修饰位点在干旱胁迫响应过程中是保守的。差异表达的磷酸化蛋白质主要定位于细胞核、叶绿体、细胞质和质膜中,这与 Zhong等[23]在矮牵牛花衰老过程中的磷酸化组学的亚细胞定位结果一致,表明磷酸化可能在转录起始和延伸、RNA 剪接和 DNA 修复中发挥作用,响应干旱胁迫。
本研究在基序分析中发现以Ser和 Thr为中心的59种类型的基序,这些基序通常被发现位于细胞核和细胞质中,它们的底物通常是一系列包括逆境信号转导途径中 MAPK 等在内的激酶[22]。MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号通路是植物应对生物和非生物胁迫的重要工具,通过信号转导响应细胞外刺激。MAPK 具有核定位的底物,如转录因子、剪接因子和组蛋白,参与植物的发育过程,这与 Lü 等[24]对短柄草进行磷酸化蛋白质组学分析的基序结果一致,并且都未鉴定到以 Tyr残基为中心的基序,可能是信号转导通路的复杂性和 Tyr磷酸化水平低。Ca2+ 是植物应对非生物胁迫的关键第二信使,Ca2+ 依赖蛋白激酶(CPK)是一类在植物中广泛存在的依赖 Ca2+ 的Ser/Thr型蛋白激酶,是重要的钙感受器[25],也是逆境胁迫中的主要调节因子[26]。本研究中,四倍体香圆在干旱胁迫下富集到大量 Ca2+ 结合相关蛋白,同时在基序中鉴定到 CPK 的底物,推测四倍体香圆在干旱胁迫下可通过调节 Ca2+ 传感器蛋白激酶基因 CPK,进而介导相关信号通路,从而响应干旱胁迫。研究证实拟南芥AtCPK6 通过磷酸化 ABF/AREB 介导 ABA 信号传导和耐旱性,揭示了 ABA 信号传导中钙依赖性 Ser/Thr 激酶的保守性机制[27]; 小麦 TaCPK34 通过直接调控靶基因的表达介导小麦的耐旱性[28]。表明 CPK 在植物响应干旱中发挥重要作用。
囊泡运输在维持细胞内膜系统的稳态、细胞内和细胞间的物质运输与信息交流以及植物的生长发育过程中发挥重要功能。细胞中蛋白质分泌途径分为常规途径(CPS)和非常规途径(UPS),目前已知 UPS途径的分泌蛋白包括无前导信号分泌蛋白和含信号肽的分泌蛋白[29],与生物胁迫和非生物胁迫应答密切相关[30]。在本研究中,GO 注释和 KEGG 分析发现有关囊泡转运、胞吐及 SNARE 结合中富集了大量差异表达的磷酸化蛋白质,表明囊泡在四倍体香圆中通过调节 CPS和 UPS之间的平衡以及改变物质运输与信号传递来应答干旱胁迫。此外,SNARE因子在植物细胞离子运输、生长发育、胁迫应答等过程中发挥重要作用[31]。不同细胞器之间的SNARE因子不同,具有一定的特异性,但种间具有高度保守性,是囊泡运输过程中的重要调控因子。研究表明,拟南芥Syt1 与 SNARE 蛋白 SNAP-25 相互作用,调控胞吞胞吐应对非生物胁迫[32]。
磷酸甘油酸激酶是糖酵解途径中关键代谢酶,通过催化作用产生糖酵解途径中第1个 ATP,同时可在线粒体中发挥蛋白激酶作用,抑制 TCA 循环。本研究中,磷酸甘油酸激酶在上调的差异磷酸化蛋白质中被鉴定到,表明四倍体香圆在干旱胁迫下可能通过加快能量代谢,响应干旱胁迫。任绪明等[33] 对黄瓜(Cucumis sativus L.)幼苗响应高盐胁迫的蛋白质组学分析发现,黄瓜幼苗通过上调细胞骨架相关蛋白维持细胞形态、运动等生命活动,从而使黄瓜幼苗适应非生物胁迫。值得注意的是,本研究中上调的差异表达磷酸化蛋白质大多含有微管蛋白/ FtsZ家族 GTPase结构域、微管蛋白 C 端结构域等,这些结构域促进离子跨膜运输维持胞质质子梯度平衡,从而响应干旱胁迫。
4 结论
用IMAC亲和富集和 TMT 标记结合的磷酸化组学技术对干旱胁迫下四倍体香圆进行磷酸化蛋白质组学分析,鉴定到662个差异表达的磷酸化蛋白质,这些蛋白质主要定位在细胞核和叶绿体中; GO 注释和 KEGG 通路中富集到大量 RNA 剪接、光合作用、SNARE 结合、囊泡转运、Ca2+ 结合等相关蛋白质,表明四倍体香圆通过调节转录翻译、RNA 加工、信号转导和物质转运等过程应答干旱胁迫; 同时,在结构域分析中发现差异表达的磷酸化蛋白质含有阳离子转运体/ATP酶、微管蛋白 C端结构域、磷酸甘油酸激酶等,通过调节质子梯度、改变激酶活性和促进能量代谢等生物过程响应干旱胁迫。