辣椒CaPEX3基因克隆及表达分析
doi: 10.7606/j.issn.1000-4025.20240216
臧巧路 , 柳璐 , 刘涵 , 王静 , 王梦 , 成妍
山西农业大学 园艺学院,山西太谷 030801
基金项目: 山西省基础研究计划(自由探索类)青年科学研究项目(202203021212454) ; 山西省博士毕业生来晋工作奖励科研项目(SXBYKY2022060) ; 山西省重点研发计划项目(专用型辣椒种质资源创新与新品种选育)(202202140601006)
Cloning and expression analysis of CaPEX3 in pepper
ZANG Qiaolu , LIU Lu , LIU Han , WANG Jing , WANG Meng , CHENG Yan
College of Horticulture, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801 , China
摘要
目的PEX 基因参与调控植物花粉发育过程,在花粉小孢子胚胎发生及单倍体培养中发挥重要作用。研究克隆了辣椒中 CaPEX3 基因,并分析其蛋白结构及表达模式,为研究 CaPEX3 基因功能提供理论依据。 【方法】用 PCR技术克隆辣椒CaPEX3 基因,并用生物信息学手段分析其蛋白结构、进化及基因调控关系,用qRTPCR技术检测CaPEX3 在不同组织及不同品种花粉中的表达量,用染色法检测不同辣椒品种的花粉活力并分析其与CaPEX3 表达量的关系。【结果CaPEX3 编码区全长1581bp,编码526个氨基酸,属于LRX 基因家族。该蛋白有磷酸化和糖基化位点,存在信号肽和跨膜结构域。CaPEX3 在花中表达量最高,且在花粉活力高的组织中基因表达量相对较高。调控网络预测发现 CaPEX3 可能通过与花发育相关基因作用参与调控花粉发育过程。 【结论CaPEX3 在花中特异表达,且表达量与花粉活力存在一定关系。基因表达分析及相关载体构建为后续研究基因功能及遗传机制提供理论基础及技术支持。
Abstract
[Objective] PEX (pollen extensin-like) gene is involved in controlling pollen development,which plays a crucial role in embryogenesis of pollen microspores and haploid culture. In this study, the authors isolated the CaPEX3 gene from pepper and analyzed its protein structure and expression pattern, which provides a theoretical foundation for further investigation into the function of the CaPEX3 gene. [Methods] CaPEX3 was cloned by PCR, and its protein structure, evolution, and gene regulation were analyzed by bioinformatics. Expression of CaPEX3 in different tissues and pollen of different varieties were detected by qRT-PCR. Pollen viability of different pepper varieties was detected by staining method and their relationship with CaPEX3 expression was analyzed. [Results] The coding region of CaPEX3 was 1581 bp in length, encoding 526 amino acids, which belongs to the LRX (leucine-rich repeats/extensins) gene family. The protein had phosphorylation and glycosylation sites, signaling peptides, and transmembrane domains. The expression level of CaPEX3 was the highest in flowers, and the gene expression was higher in tissues with high pollen vitality. The regulatory network predicted that CaPEX3 might be involved in the regulation of pollen development through the action of genes related to flower development. [Conclusion] CaPEX3 was specifically expressed in flowers, and a correlation was observed between its expression level and the activity of pollen grains. The analysis of gene expression and the construction of related vectors provided a theoretical foundation and technical support for the subsequent investigation of gene function and mechanism of CaPEX3.
辣椒(Capsicum annuum L.)是1年生或多年生植物,属于茄科(Solanaceae)辣椒属(Capsicum),是中国种植面积最大的蔬菜作物,也是重要的药食同源蔬菜,具有丰富的营养及加工价值,经济效益极高[1-2]。目前辣椒育种以传统方式为主,这种方式具有时间长、工作量大、优良品种生产及利用效率低,并且存在不稳定性等特点[3]。单倍体育种可加速育种进程、缩短育种周期、改善育种效果,是当前非常重要的育种技术之一,即利用花药和游离小孢子培养的方式获得单倍体植株,然后经秋水仙素等处理加倍为双单倍体,获得有活力、能正常结实的纯合体的育种方式[4-5]。小孢子培养技术是获得单倍体途径的重要育种手段,主要是通过胚胎发生途径发育成植株,具有单倍性、稳定遗传、育种周期短等特点[6-7]。研究发现小孢子胚胎发生效率与花粉活力及发育时期相关[8-9]。因此深入解析辣椒花粉发育的遗传机制有助于利用分子手段提高小孢子胚胎发生及单倍体育种效率。
PEX(pollen extensin-like)基因,属于LRX(leucine-rich repeats/extensins)基因家族成员,其在繁殖器官,尤其在花粉中高表达,进而参与调控花粉发育过程[10-11]LRX 基因家族编码的蛋白质含有1个富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeats,LRR)和1个伸展蛋白结构域(extensins,EXT),且根据组织特异性将成员分成两大类,在营养器官中表达用LRX 表示,在繁殖器官中表达用 PEX 表示[12]。拟南芥中 LRX8LRX9LRX10LRX11PEX1-4)在花粉及花粉管壁中表达,与花粉萌发及花粉管的伸长密切相关,分析以上基因的突变体后发现,突变体中胼胝质和果胶沉积发生异常,花粉管及花粉管异形生长且顶端突起及破裂,进而它们的花粉萌发率显著降低,受精及种子发育都受到严重抑制[10-1113]。水稻OsPEX1 基因在花粉中高表达,且降低其表达后的转基因植株花粉败育,结实率显著下降,仅为 10%~30% [14]。此外,拟南芥 LRX 蛋白能与植物多肽类激素 RALF(rapid alkalinization factor)家族部分蛋白发生互作来调控花粉管伸长[15-16]。综上研究,PEX 基因在调控花粉发育方面发挥重要作用,但辣椒中有关PEX 的研究鲜见报道。
该研究鉴定出辣椒中PEX 同源基因并对其进行克隆,注释为 CaPEX3,对其蛋白序列进行了生物信息学指标分析,选取多个物种进行序列比对并构建系统进化树分析 CaPEX3 蛋白的亲缘关系。利用qRT-PCR 分析 CaPEX3 基因在不同组织中的表达模式,并测定不同品种的花粉活力。同时,利用 CaPEX3启动子序列预测出调控其表达的上游调控因子,用 CaPEX3蛋白序列预测出相互作用蛋白,并据此构建分子调控网络。最后构建该基因的过表达载体和病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)载体,以期进行辣椒的遗传转化,为后期深入研究该基因功能及分子遗传机制奠定理论基础与技术指导。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
试验材料:选取的辣椒材料为甜椒品种‘晋椒 204’,该品种由山西农业大学园艺学院辣椒课题组保存并提供。
试验试剂:RNA 提取试剂盒、大肠杆菌感受态 DH5α、克隆载体均购于北京金沙生物科技有限公司; 质粒提取试剂盒和 DNA 凝胶回收试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司; 反转录试剂盒及 KOD酶购自东洋纺(上海)生物科技有限公司; 荧光定量试剂盒购于 Takara-宝日医生物技术(北京)有限公司; ClonExpressⅡ One Step Cloning Kit试剂盒购自南京诺唯赞公司。
1.2 试验方法
1.2.1 引物设计
从辣椒‘zunla’基因组信息得到CaPEX3 基因参考序列,用 Primer Premier 5.0软件设计CaPEX3 基因的特异性上游引物和下游引物,上游引物序列: CaPEX3-F,5'-ATGCAGGTGTATCGATGTTCTTTCATTCTG-3'; 下游引物序列:CaPEX3-R,5'-TTAATATCCTTGGAAGATTGGTGGAGGTGG-3'。引物由生工生物(上海)股份有限公司合成。
1.2.2 CaPEX3 基因克隆
以辣椒花苞为材料,按照 RNA 提取试剂盒提取总 RNA,利用反转录试剂盒进行反转录并获得辣椒cDNA。以辣椒cDNA 为模板,对CaPEX3 基因进行扩增。PCR反应总体系为25μL,包括:cDNA 模板 1μL,KOD 酶 12.5μL,正、反引物各 1μL,ddH2O 9.5μL。PCR 扩增程序:94℃ 预变性 2 min; 98℃变性10s; 56℃退火5s; 68℃延伸15s; 循环35次。再68℃延伸2 min后4℃保存。用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物并回收。回收 PCR产物后,按照克隆载体说明书,将目的基因连接到 TA 克隆载体上,并转化到大肠杆菌 DH5α 中,提取质粒经 PCR 鉴定后送公司进行测序,保存测序正确的菌液。
1.2.3 CaPEX3 生物信息学分析
根据得到的CaPEX3 基因序列,用 ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)找到氨基酸序列。为了解 CaPEX3蛋白性质,用 ExPASy 在线网站分析工具 Prot Param(https://web.expasy. org/protparam/)预测辣椒 CaPEX3 蛋白的分子质量、等电点、亲疏水性等理化性质。用在线网站 NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetNGlyc/)预测 CaPEX3 蛋白 N-糖基化位点。用在线网站 NetPhos3.1(https://services. healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)预测 CaPEX3蛋白磷酸化位点。用在线网站 SignalIP4.1(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)预测 CaPEX3 蛋白的信号肽。用 TMHMM2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测 CaPEX3 蛋白跨膜结构。用辣椒 CaPEX3 蛋白的氨基酸序列在 NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行 Blast,得到其他物种的同源序列并下载,用 DNAMAN 软件对得到的多个物种 PEX3蛋白氨基酸序列进行比对,之后用邻近法在 MEGA-X 中构建系统发育树,自展值(bootstrap)设置为1000次重复。
1.2.4 CaPEX3 基因的组织表达分析
提取辣椒不同组织以及辣椒不同品种花粉的 RNA,按照试剂盒方法反转录得到cDNA。以辣椒 CaUBI3(登录号:AY486137)为内参基因,设计引物(CaUBI3-F/R),根据CaPEX3 序列设计荧光定量 PCR 引物(qCaPEX3-F/R)(表1)。qRT-PCR 反应在(QuantStudioTM 3 Real-Time PCR Instrument)仪器上完成,反应总体系为25μL,包括:TB Green Premix Ex Taq Ⅱ Fast qPCR(2×)为12.5 μL,正反引物各1μL,cDNA 模板2μL,ddH2O 8.5 μL。扩增程序:95℃预变性30s; 95℃变性15s; 60℃退火30s; 72℃延伸30s; 循环45次。用2-ΔΔCT法计算CaPEX3 基因相对表达量。
1.2.5 花粉活力分析
研究主要采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法[17]。取少量花粉于载玻片上,加 1~2 滴 TTC溶液,盖上盖玻片,将玻片放在35℃的恒温培养箱中,15min后置于光学显微镜下观察、计数,有活力的花粉被染成红色,无色则为没有活力的花粉或不育花粉。每个品种观察10个不重复视野,每个视野花粉粒大于50个,观察花粉染色情况。
1.2.6 分子调控网络预测
根据辣椒基因组数据信息,获得 CaPEX3启动子序列。用 PlantRegMap数据库(http://plantregmap.gao-lab.org/binding_site_prediction.php)预测能够与其结合的转录因子。用 STRING 数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)和拟南芥 PEX3蛋白模型预测辣椒 PEX3的互作蛋白。
1.2.7 植物表达载体构建
过表达载体构建:以含有CaPEX3 基因的质粒为模板,根据基因序列信息设计引物,正向引物加 BamHⅠ酶切位点,反向引物加 PstⅠ酶切位点,用引物(CaPEX3-OE-F/R)进行 PCR 扩增得到带酶切位点的基因片段。用 ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit将PCR扩增产物克隆入 PHG 表达载体中,并转化大肠杆菌,对抗性克隆用引物(dCaPEX3-F/PHG-R)进行 PCR 鉴定并测序,所用引物序列见表1
VIGS载体构建:根据 CaPEX3 序列,目的基因靶标序列用 SGN-VIGS在线软件设计。根据序列信息设计引物,正向引物加 BamHⅠ酶切位点,反向引物加 SacⅠ 酶切位点,用引物(CaPEX3-VIGS-F/R)进行 PCR 扩增得到带酶切位点的基因片段。pTRV2载体用双酶切处理并回收,与基因片段进行重组,并转化大肠杆菌,对抗性克隆用引物(CaPEX3-VIGS-F/pTRV2-R)进行 PCR 鉴定并测序,所用引物序列见表1
1研究所用引物
Table1Primers used in this study
注:F.正向引物; R.反向引物; 酶切位点的碱基序列用下划线标注。
Note: F, forward primer. R, reverse primer. The sequences underlined indicate the restriction enzyme cutting sites.
1.2.8 数据处理
用SPSS 21.0软件分析数据,用邓肯多重比较法在P<0.05水平下分析差异显著性,用 Origin 2021软件作图。
2 结果与分析
2.1 辣椒CaPEX3 基因克隆
以辣椒cDNA 为模板进行 PCR 扩增,产物经回收纯化后转化大肠杆菌,筛选阳性克隆并测序。结果(图1)显示,1581bp处呈现目的条带,与预期条带长度吻合。
1CaPEX3 基因 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测
Fig.1Detection of PCR amplification products of the CaPEX3 gene by agarose gel electrophoresis
M. DNA marker 2000;1-2. CaPEX3基因的 PCR扩增产物。
M, DNA marker 2000.1-2, PCR amplification products of the CaPEX3 gene.
2.2 CaPEX3蛋白生物信息学分析
2.2.1 理化性质分析
通过ExPASy工具进行理化性质分析,结果显示,CaPEX3氨基酸序列为526aa,分子质量为57.87kD,等电点为7.89,是碱性蛋白,分子式C2635H4050N682O747S20,原子总数8134,不稳定系数56.69(不稳定系数<40时稳定),属于不稳定蛋白,脂肪系数75.21,疏水值为-0.339,为亲水性蛋白。
2.2.2 蛋白修饰位点及结构预测分析
用 NetNGlyc 1.0 Server 预测 CaPEX3 蛋白 N-糖基化位点,结果(图2,A)表明,CaPEX3蛋白有4个 N-糖基化位点,分别位于110,230,280,331 位氨基酸残基处。
用 NetPhos3.1对 CaPEX3蛋白磷酸化位点进行分析,发现其具有51个丝氨酸、17个苏氨酸、12 个酪氨酸的磷酸化位点(图2,B)。推测 CaPEX3蛋白活性的调控可能与磷酸化和糖基化作用有关。
对 CaPEX3蛋白是否存在信号肽进行分析,结果显示,蛋白信号肽的概率为0.926,推测该蛋白可能有信号肽,第23和24个氨基酸之间位置有1个信号肽剪切位点,推测该蛋白可能为分泌蛋白(图2,C)。对CaPEX3蛋白是否存在跨膜结构域进行分析,结果(图2,D)显示,该蛋白有1个跨膜结构域。
2CaPEX3蛋白修饰位点及结构预测
Fig.2Prediction of modification sites and structure of CaPEX3 protein
A,B.糖基化及磷酸化位点预测;C,D.信号肽及跨膜结构域预测。
A, B. Prediction of glycosylation and phosphorylation sites. C, D. Prediction of signal peptides and transmembrane domains.
2.2.3 PEX3同源蛋白的序列比对及系统进化树分析
通过Blast比对,从 NCBI中下载了多个物种的 PEX3同源蛋白序列,包括马铃薯 StPEX3(XP_ 006342607.1,Solanum tuberosum)、烟草 NaPEX3(XP_016515572.1,Nicotiana tabacum)、榴莲 DzPEX3(XP_022746585.1,Durio zibethinus)、君迁子 DlPEX3(XP_052191356.1,Diospyros lotus)、油菜 BnPEX3(XP_048607115.1,Brassica napus)、萝卜 RsPEX3(XP_018438143.2,Raphanus sativus)、灰芥 HiPEX3(KAJ0241842.1,Hirschfeldia incana)。同源序列对比结果(图3,A)显示,CaPEX3蛋白与马铃薯、烟草同源序列相似度最高,分别为85.93% 和85.50%,与灰芥相似度最低,为59.91%,且均含有保守结构域。
系统进化结果(图3,B)显示,CaPEX3蛋白与马铃薯、烟草 PEX3聚类在同一分支上,亲缘关系较近。由此可推测CaPEX3 基因在辣椒中的功能可能与马铃薯、烟草中的同源基因功能相似。
2.3 CaPEX3 基因表达分析
用qRT-PCR对CaPEX3 在辣椒不同组织(根、茎、叶、花)中的表达模式进行分析,结果(图4,A)显示,CaPEX3 基因在辣椒不同组织中表达存在显著差异,其在花中的相对表达量最高,在叶中有微量表达,在茎和根中几乎没有表达,推测该基因在花中特异表达并调控辣椒花的发育。进一步对辣椒不同品种花粉组织(16D1、16C01、3C3)中CaPEX3 的表达模式进行分析,结果(图4,B)显示,在 16C01 中 CaPEX3 表达量显著高于3C3和16D1。
3CaPEX3及其同源蛋白的氨基酸序列比对和进化关系分析
Fig.3Amino acid sequence alignment and evolutionary relationship of CaPEX3 and its homologous proteins
A.CaPEX3及其同源蛋白的氨基酸序列比对。黑色划线部分是预测的富含亮氨酸的重复序列结构域(LRR),红色划线部分是预测的伸展蛋白结构域(EXT);B. CaPEX3 蛋白进化关系分析。数值为进化分支的可靠程度。
A. Amino acid sequence alignment of CaPEX3 and its homologous proteins. The black underlined part is leucine-rich repeats domain (LRR) , the red underlined part is extension domain (EXT) . B. Evolutionary relationship analysis of CaPEX3 proteins. Values are the reliability of evolutionary branches.
4CaPEX3表达模式及花粉活力分析
Fig.4Analysis of the expression pattern of CaPEX3 and pollen viability
A.CaPEX3在不同组织的表达模式;B.CaPEX3基因在不同品种花粉组织中的表达模式;C.不同品种花粉活力分析。不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。
A. The expression pattern of CaPEX3 in indifferent tissues. B. The expression pattern of CaPEX3 in pollen of different varieties. C. Analysis of pollen viability in different varieties. Different lowercase letters represent significant difference (P<0.05) .
为了进一步阐释CaPEX3 对辣椒花粉发育的影响,对上述品种花粉进行活力测定,结果(图4,C)显示,16C01花粉活力显著高于3C3和16D1,这与基因表达模式基本一致。综上所述,CaPEX3 可能在辣椒花及花粉发育中发挥一定作用。
2.4 分子调控网络构建
根据 CaPEX3启动子序列,用 PlantRegMap在线数据库预测能够与其结合的转录因子,筛选出与花粉发育相关的转录因子 MYB(v-myb avain myeloblastosis viral oncogene homolog)、BES1(BRI1 EMS SUPPRESSOR 1)、C2H2(Cysteine 2 Histidine 2)、bZIP(basic region-leucine zipper)。用 STRING 数据库进行辣椒 PEX3 蛋白的互作网络预测分析。结果显示,PEX3与多个蛋白互作,其中与花粉发育相关的 BGAL3(BETA-GALACTOSIDASE 3)、ADF2(ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR 2)蛋白存在互作。根据筛选出来的转录因子和互作蛋白,绘制出辣椒 PEX3蛋白调控花粉发育的分子调控网络图(图5)。
2.5 植物表达载体构建
将构建成功的CaPEX3 过表达载体转化进大肠杆菌,对抗性菌落进行 PCR 鉴定,如(图6,A)所示,在500~750bp处有清晰的条带,进一步测序结果显示片段大小为555bp,表明过表达载体构建成功。将构建成功的 VIGS载体转化进大肠杆菌,对抗性菌落进行 PCR 鉴定,如(图6,B)所示在500~750bp处有清晰的条带,进一步测序结果显示片段大小为581bp,表明 VIGS载体构建成功。
5辣椒 PEX3蛋白分子调控网络图
Fig.5Molecular regulatory network of the pepper PEX3 protein
6菌落 PCR鉴定重组植物表达载体
Fig.6Identification of recombinant plant expression vectors by PCR
A.过表达载体鉴定;B.VIGS载体鉴定;M.DNA marker 2000; P.阳性对照;1-4.目的基因扩增产物。
A. Identification of over-expression vector. B. Identification of VIGS vector. M, DNA marker 2000. P, positive control.1-4, amplification product of target gene.
3 讨论
单倍体育种可以有效分离出特殊性状的材料,且能够有效缩短育种周期,花粉小孢子胚胎发生作为重要的单倍体育种手段,仍具有很多的问题,如花粉活力不好、胚状体发生效率低等[18]。因此挖掘花粉发育相关基因有助于利用基因工程手段改善花粉活力[19]PEX 是在花粉中高表达的基因,参与调控花粉发育过程[10-11]。拟南芥中 PEX1-4 在开放的花、花序和角果中均有较高表达,在根茎中表达量较低[13]。水稻 OsPEX1 在花药中高表达,且表达量越低花粉育性越差[14]。本研究在辣椒中鉴定出 CaPEX3 基因,其蛋白具有LRX 基因家族典型的结构域,且在进化中较为保守。CaPEX3 在花中的相对表达量显著高于其他组织,值得注意的是,花粉活力高的组织中基因表达量相对较高,推测CaPEX3 参与调控辣椒花粉发育过程。PEX 参与调控花粉发育过程,但其遗传调控机制尚不明确。本研究利用 CaPEX3的启动子及蛋白序列预测其上游调控转录因子与其互作蛋白,以期为后续分子机制的解析提供思路。
研究发现,水稻 MYB 家族成员突变体表现为减数分裂轻微滞后,花粉外壁形成异常,且在成熟的白色花药中缺乏可见花粉[20]。在拟南芥中,BES1 蛋白可以直接结合在基因的启动子区域上,进而调控花药和花粉发育过程[21]。此外,AtbZIP18 在花粉中高表达,且其蛋白可与 AtbZIP34/52/61 共同作用参与花粉发育过程[22]。拟南芥中C2H2-ZFP(zinc finger protein)成员在早期花药中高表达,在花粉壁发育中起重要作用,其突变体小孢子发育受阻[23]。油菜大部分BGAL 基因在生殖器官如花药及角果中高表达,可能参与花及花粉的发育过程[24]ADF 基因对花粉管的生长以及萌发具有重要调控作用[25]。从这些研究结果可以推测辣椒CaPEX3 可能被上述转录因子调控,并与其他蛋白发生互作影响花粉或花粉管的发育过程,但其具体功能及机制有待进一步验证。
4 结论
研究从辣椒中鉴定到CaPEX3 基因,组织表达特性分析表明其在花中特异表达。进一步对不同品种的花粉活力及CaPEX3转录表达量进行分析后发现,该基因表达与花粉活力存在一定关系。分子网络调控预测表明CaPEX3 通过与花发育相关基因作用参与调控花粉发育过程。进一步构建了CaPEX3 基因的过表达载体和 VIGS载体,后续会将其转化入辣椒材料中,通过对转基因材料的花粉特性及基因表达情况进行分析,明确该基因在花粉发育过程中的功能及作用机制,为提高辣椒花粉小孢子胚胎发生效率及加快单倍体育种进程提供新的思路。
1CaPEX3 基因 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测
Fig.1Detection of PCR amplification products of the CaPEX3 gene by agarose gel electrophoresis
2CaPEX3蛋白修饰位点及结构预测
Fig.2Prediction of modification sites and structure of CaPEX3 protein
3CaPEX3及其同源蛋白的氨基酸序列比对和进化关系分析
Fig.3Amino acid sequence alignment and evolutionary relationship of CaPEX3 and its homologous proteins
4CaPEX3表达模式及花粉活力分析
Fig.4Analysis of the expression pattern of CaPEX3 and pollen viability
5辣椒 PEX3蛋白分子调控网络图
Fig.5Molecular regulatory network of the pepper PEX3 protein
6菌落 PCR鉴定重组植物表达载体
Fig.6Identification of recombinant plant expression vectors by PCR
1研究所用引物
Table1Primers used in this study
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