摘要
【目的】 滇山茶为云南八大名花之首,其耐寒性较差，从生理与分子层面探讨2种倍性滇山茶的耐寒性，可为滇山茶耐寒基因挖掘及分子育种提供参考。【方法】以野生滇山茶四倍体(4X)和六倍体(6X)的1年生幼苗为材料,测定低温(-4 ℃)胁迫处理后的滇山茶叶片生理指标及转录组测序。【结果】从叶片表型观测看，在胁迫期至复温期中,六倍体叶片受损程度相对较小，抗寒表现优于四倍体；从生理指标结果看，除MDA及GSH外，六倍体的其他生理指标含量积累均大于四倍体；将抗氧化酶活性与其差异基因进行相关性分析发现，在四倍体和六倍体中，与GSH含量及POD活性呈显著相关性的基因分别为5个和7个、7个和17个，仅六倍体有2个基因与SOD活性显著相关。【结论】六倍体较四倍体能更有效抵御植株遭受的低温胁迫伤害；抗氧化酶相关基因可能通过调控其活性参与对低温的响应。
Abstract
[Objective] Camellia reticulata is the first of the eight famous flowers in Yunnan, but it is poor in cold tolerance. This paper discusses the cold tolerance of two ploidy C. reticulata from the physiological and molecular levels, which can provide references for the mining of cold tolerance genes and molecular breeding of C. reticulata. [Methods] Using tetraploid (4X) and hexaploid (6X) annual seedlings of wild C. reticulata as materials, physiological indexes and transcriptomic sequencing of leaves of C. reticulata were analyzed after low temperature (-4 ℃) treatment (0 h, 24 h, 72 h, reheated for 48 h and reheated for 72 h). [Results] Based on the observation of leaf phenotype, from the stress period to the rewarming period, the damage degree of the hexaploid leaves was relatively smaller, and the cold resistance performance of the hexaploid leaves was better than that of the tetraploid leaves. According to the results of physiological indexes, except for MDA and GSH, the accumulation of other physiological indexes of the hexaploid was greater than that of the tetraploid. Correlation analysis of antioxidase activity and the differential genes showed that 5 and 7, 7 and 17 genes were significantly correlated with GSH content and POD activity in tetraploid and hexaploid, respectively, and only 2 genes in hexaploid were significantly correlated with SOD activity. [Conclusion] Hexaploid is more effective than tetraploid in alleviating the damage of plants under low temperature stress. Antioxidase-related genes may be involved in the regulation of low temperature resistance by regulating their activity.
滇山茶（Camellia reticulata L.）是山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）植物，又称云南山茶、腾冲红花油茶、南山茶、油茶果等。滇山茶不仅是云南八大名花之首，也是中国十大名花之一[1]。滇山茶树姿虬劲、叶色常绿、花色鲜艳是冬春之际的重要观赏花木，但少数山茶品种耐寒性较差，严重影响了滇山茶北方市场的发展，因此选育耐寒性山茶品种日益重要[2]。滇山茶野生居群有3种倍性，即二倍体、四倍体和六倍体，其中四倍体和六倍体在体细胞间期核特征、前期染色体形态特征和花外部形态特征等方面均较为相似，且二者地理分布连续[3]。目前，滇山茶的研究大多集中在表型性状[4]、花色[5]及干旱胁迫[6-7]等方面，对不同倍性滇山茶的耐寒性评价研究较少，且对滇山茶的耐低温生理机制及抗氧化酶相关基因资源的研究也鲜有涉及。
当植物受到冻害时会使植物体内活性氧（ROS）急剧增加，细胞膜系统会受到破坏，从而影响植物的正常生命活动，而植物超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）等保护酶系统通过去除 H2O2 防止膜过氧化，减少或防止应激对生物膜的损伤，使植物在一定程度上忍耐、减缓或抵御低温伤害[8-9]。低温下过量的活性氧会使细胞膜产生膜脂过氧化物，其最终的产物是丙二醛（MDA），过量的 MDA 会引起细胞代谢失调，从而毒害细胞，故可通过 MDA 的含量变化，分析膜系统受损程度以及植物的耐寒能力[10]。植物体内细胞通过合成和积累渗透调节物质（可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸）提高细胞液浓度，从而降低细胞渗透势，防止细胞结冰，以抵御环境胁迫带来的不利影响[11]。李世荣[12]发现，Pro、 MDA 和SOD 等生理指标可作为不同品种山茶抗寒性评价的有效标准。白如意等[13]研究发现增强南瓜（Cucurbita moschata）叶片的抗氧化酶活性和渗透调节物质含量，可以提高南瓜幼苗耐低温能力。大量研究表明植物响应低温胁迫后的生理变化是由其基因表达差异造成的，因此从分子层面研究滇山茶在低温胁迫下生理相关基因表达也非常重要。王江英等[14]以杜鹃红山茶（C.azalea）为材料，发现过表达CaAPX1 基因可以清除低温下产生的有害物质来提高自身防御能力。庄得凤等[15]发现单瓣黄刺玫（Rosa xanthina）经低温胁迫后的 RxSODs 基因和 RxPODs 基因均上调表达，同时 SOD 和 POD 活性也逐渐升高，这表明在低温胁迫时，这些抗氧化基因与其生理响应可能存在重要的相关性。黄丽芳等[16]发现西葫芦（Cucurbita pepo）叶片中的 CpPOD 基因在低温处理后，表达量相对于对照组上调表达。平璐[17]发现将从紫花苜蓿（Medicago sativa）克隆的 Cu/Zn-SOD 基因进行过表达转化到矮牵牛（Petunia hybrida）植株中，能显著提高矮牵牛的耐冷性。
综上，本研究从生理与分子层面共同探讨滇山茶不同倍性的耐寒性差异，研究结果有助于深入了解不同倍性滇山茶应答低温胁迫的分子机制，为滇山茶耐寒功能基因挖掘提供参考，也为后续的抗寒基因克隆和分子育种提供有力支持。
1 材料和方法
1.1 试验材料
试验材料为野生滇山茶四倍体（4X）和六倍体（6X）1年生实生苗，栽培用基质成分与比例为草炭土∶ 蛭∶珍珠岩=7∶1∶1，置于西南林业大学后山树木园温室大棚内培养。4X山茶种子采于四川省会东县马龙乡（26.7681°N，102.6813°E），6X山茶种子采于云南省富民县东村镇（25.5267°N，102.6230°E）。
1.2 低温胁迫处理
选取野生滇山茶4X 和6X 各12株生长健壮、形态大小基本一致的幼苗放入培养箱中适应培养1周（时间7:00—19:00; 温度25℃; 光照4000lx; 湿度70%）。适应培养后将处理温度设置为-4℃，进行低温处理。每个处理设置3个生物学重复，分别在低温处理0，24，72h和复温（Re）48h、72h时对叶片进行取样，用液氮速冻，置于-80℃超低温冰箱内保存。
1.3 表型观测
选取长势良好的1年生4X 和6X 滇山茶幼苗各3盆，共6盆，放入设置好的培养箱（时间7:00— 19:00; 温度-4℃; 光照4000 lx; 湿度70%）中低温处理72h，每日18:00进行拍照记录，观测滇山茶幼苗叶片表型变化情况。
1.4 生理生化指标测定
超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（NBT）还原法测定[18]; 过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚比色法测定[18]; 过氧化氢酶（CAT）活性采用紫外吸收法测定[19]; 还原型谷胱甘肽（GSH）采用 5，5-二硫代双-2-硝基苯甲酸（DTNB）显色法测定[18]; 脯氨酸（Pro）含量采用磺基水杨酸法测定[19]; 可溶性糖（SS）采用蒽酮比色法测定[19]; 可溶性蛋白（SP）采用考马斯亮蓝法测定[19]; 丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定[18]，重复3次。
1.5 转录组测序
为明确在低温胁迫及复温条件下4X 和6X 野生滇山茶幼苗抗氧化酶相关基因的表达差异，分别选取低温处理0，24，72h以及复温（Re）48h、72h 进行取样，每个时间点3个生物学重复，共30个样本由武汉迈维科技有限公司进行 RNA 提取和测序分析，提取样品总 RNA，进行质量检测合格后建库并测序。之后对测序得到的数据进行质控，用 RSEM 软件计算转录本的表达量，然后根据转录本长度计算每个转录本的 FPKM 值，FPKM 值大于1 记为表达。用DESeq2 [7-8]进行样品组间的差异表达分析，以|log2ɑFC|≥1，且 FDR<0.05为差异基因的筛选条件在 Unigene中筛选差异基因（differential gene，DEGs），而后在差异基因中筛选出与抗氧化酶相关的基因进行相关分析。
1.6 数据处理
用Excel对数据进行处理，用 Origin 2022、SPSS 26、TBtools、迈维云平台（https://cloud.metware.cn）和微生信（https://bioinformatics.com.cn）进行绘图。
1.7 qRT-PCR验证
为验证转录组数据的准确可靠性，选取6个差异表达基因进行 qRT-PCR 分析验证，分别提取处理组叶片的总 RNA，然后反转录合成 cDNA，用 Primer Premier 6.0设计引物，引物序列见表1。荧光定量反应体系参照擎科生物 2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I）。以 Actin 作为内参基因，仪器为LightCycler® 480荧光定量PCR仪。采用法计算表达量。
表1qRT-PCR 引物序列
Table1qRT-PCR primer sequences
2 结果与分析
2.1 低温胁迫下滇山茶表型变化
由图1可知，选取长势健壮的1年生4X 和6X 滇山茶各3株幼苗，进行-4℃低温胁迫处理，通过表型观测发现，2种倍性滇山茶在低温胁迫下表型主要变化为叶片褪色黄化并干枯。
图1低温胁迫下滇山茶表型变化
Fig.1Phenotypic changes of C. reticulata under low temperature
Re.复温。
Re, rewarming.
在低温胁迫72h时，4X和6X叶片均出现褪色黄化现象。在 Re72h后，4X 叶片黄化干枯明显且掉落，6X叶片干枯黄化，但未掉落。在复温5d后，4X叶片均掉落，6X 还剩10%的叶片黄化干枯但未掉落。复温10d后，6X 叶片均掉落。4X 和6X 均未得到恢复，植株干枯死亡。从观测结果来看，六倍体的耐寒性较强。
2.2 低温胁迫对野生滇山茶生理生化指标的影响
如图2所示，在低温及复温处理过程中，4X 和 6X的SOD活性均呈先下降后上升再下降再上升趋势，均在 Re72h升至最高，与0h相比分别增加了 45.45%和12.47%; POD活性在4X 中呈先上升后下降趋势，在6X 中则呈先下降后上升趋势，4X 和 6X分别在 Re48h和 Re72h升至最高，与0h相比分别增加了498.16%和345.77%; CAT 活性在 4X和6X中均呈先下降后上升再下降再上升趋势，4X和6X均在 Re48h降至最低，与0h相比，分别下降了58.63%和72.91%; GSH 含量在4X中呈先上升后下降趋势，在6X 中则呈先上升后下降再上升再下降趋势，4X和6X均在 Re48h升至最高，与 0h相比，分别增加了217.09%和98.22%。可见，4X的 SOD 和 POD 活性变化幅度比 6X 的大，且 SOD、POD和 CAT 活性在6X 中比4X 中高，而4X 的 GSH 含量比6X的高。
在低温及复温处理过程中，MDA 含量在4X 中呈先下降后上升再下降再上升趋势，在6X 中则呈先下降后上升再下降趋势，4X 在胁迫0h最高，而 6X则在 Re48h升至最高。4X 和6X 的 MDA 含量均在 Re48h变化幅度最大，与0h相比，4X下降了52.01%，而6X则增加了94.49%，且 MDA 含量在4X低温胁迫期中比6X 高。4X 和6X 的 Pro含量总体均呈先上升后下降再上升趋势，均在 Re72h 升至最高，与 0h 相比，在 Re72h 时分别增加了 57.14%和435.06%; SS含量在4X 中呈先下降后上升再下降趋势，在6X 中则呈下降趋势，均在 Re72h降至最低，与0h相比，分别下降了33.25%和 32.28%; SP含量在4X 中呈先上升后下降趋势，在 6X中则呈先上升后下降再上升趋势，4X 和6X 分别在 Re48h和 Re72h升至最高，与0h相比，分别增加了 182.59% 和 13.35%。在低温胁迫期间 6X的 Pro、SS和 SP 含量比4X 高，4X 的 MDA 含量比6X高（图3）。
图2低温胁迫对野生滇山茶叶片抗氧化酶活性和 GSH 含量的影响
Fig.2Effects of low temperature stress on antioxidant enzyme activity and GSH content in leaves of wild C. reticulata
不同小写字母表示处理时间之间差异显著（P<0.05）。下同。
The data labeled with different lowercase letters indicate significant difference among treatment time (P＜0.05) . The same as below.
图3低温胁迫对野生滇山茶叶片丙二醛和渗透调节物质含量的影响
Fig.3Effects of low temperature stress on the content of malondialdehyde and osmoregulatory substances in leaves of wild C. reticulata
2.3 主成分分析
对2种倍性滇山茶的转录组数据进行主成分分析，根据图4可知，4X 和6X 两组之间的样本分布较分散，存在明显差异，组内样本分布较为集中，差异较小，代表样品重复性较好，可进行下一步分析。
图4主成分分析
Fig.4Principal component analysis
2.4 2种倍性滇山茶差异基因分析
在2种倍性滇山茶转录组数据库中，对4X 和 6X组间用|log2αFC|≥1，FDR<0.05作为筛选条件进行差异表达基因筛选，共筛选得到了 84378 个 DEGs。T1与 H1相比，有17076个 DEGs，其中包括8975个 DEGs上调表达，8101个 DEGs下调表达。T2与 H2相比，有12931个 DEGs差异表达（6259个上调表达，6672个下调表达）。T3与 H3 相比，有12795个 DEGs差异表达（7429个上调表达，5366个下调表达）。T4与 H4相比，有24757 个 DEGs差异表达（11644个上调表达，13113个下调表达）。T5与 H5相比，有16819个 DEGs差异表达（7287个上调表达，9532个下调表达）（图5，A）。在 2 个倍性的 5 个时期对比中发现，共有 496个 DEGs在5个时期均有差异表达（图5，B）。
2.5 抗氧化酶相关差异表达基因的筛选
用2种倍性滇山茶各个时期中共有的 496 个 DEGs进行抗氧化酶相关基因的筛选并编号，其中筛选到与 POD 相关的差异表达基因有 35 个; 与 SOD相关的差异表达基因5个，其中包括3个Cu/Zn-SOD 基因，2个 Fe/Mn-SOD 基因; 与 GSH 相关的差异基因有谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、谷胱甘肽合成酶（GSS）和谷胱甘肽二硫化物还原酶（GSR）3种基因，共筛出31个 DEGs，其中 GST 有28 个 DEGs、GSS 有 2 个 DEGs、GSR 有 1 个 DEG。另外，胁迫期（0h vs 72h）与恢复期（72h vs Re 72h）相比，恢复期的下调基因有所增加。6X 与 4X 相比，4X 胁迫期中 CrSODs 的下调基因和恢复期中 CrGSHs的上调基因有所增加（表2）。
图52种倍性滇山茶差异表达基因分析
Fig.5Differential gene analysis of two kinds of C. reticulata
A.上/下调基因统计; B.2种滇山茶同时期差异表达基因分析; T.四倍体; H.六倍体; 数字1、2、3、4、5分别表示低温处理下0h、24h、72h、Re 48h、Re 72h。下同。
A. Up/down-regulated gene statistical map. B. Analysis of differential expression genes of two kinds of C. reticulata in the same period. T. Tetraploid. H. Hexaploid. The numbers 1, 2, 3, 4, and 5 represent 0 h, 24 h, 72 h, Re 48 h, and Re 72 h under low temperature treatment, respectively. The same as below.
表2抗氧化酶相关差异基因上下调分析
Table2Up/down-regulation analysis of antioxidase-related differential genes
2.6 抗氧化酶相关基因表达量热图分析
KEGG 富集通路分析中发现POD 基因全部富集在苯丙烷类生物合成通路中，为木质素合成的下游关键基因。如图6，A 所示，4X 和 6X 中的 CrPODs基因在低温胁迫及复温处理下其表达量发生了显著的变化，有先下调再上调和先上调再下调2 种变化趋势。4X 和6X 中的 CrPODs 基因表达量变化趋势相似，Cluster1和 Cluster2的CrPODs 均在胁迫后基因表达量最低，在复温期的基因表达量高，但4X中Cluster1的基因表达量在 Re48h达到最高之后，随着复温时间延长而下降，Cluster2则在 Re72h中最高，而6X中 Cluster1的基因表达量在 Re72h最高，Cluster2则在 Re48h最高，之后随着复温时间延长而下降。同时，4X 中 Cluster4 和 Cluster5的CrPODs 基因在胁迫72h后的表达量最高，而6X 则是在胁迫24h后的表达量最高; 4X 中 Cluster3的3个基因在复温期变化不明显，而6X 中 Cluster3的5个基因在复温期为上调表达。6X 的CrPODs基因表达倍数显著高于4X。
在 KEGG 富集通路分析中发现 GSH 相关基因主要富集在谷胱甘肽代谢通路中。如图6，B 所示，4X 中的 CrGSHs 基因与CrPODs 基因的变化趋势相似，Cluster1和 Cluster2的CrGSHs 基因表达量均在复温期最高，Cluster1的基因表达量在 Re48h最高，而 Cluster2则在 Re 72h最高，Cluster3 和 Cluster4的CrGSHs基因表达量均在胁迫期高，其中 Cluster3的基因表达量在胁迫24h后最高，而 Cluster4则在胁迫72h后最高。6X 中 Cluster1的 CrGHSs 基因与 4X 中 Cluster3 和 Cluster4 的 CrGSHs基因变化趋势相似，5个CrGSHs 基因表达量在胁迫24h后最高，7个CrGHSs基因则在胁迫72h后最高。同时，6X 中 Cluster3和 Cluster4 的CrGSHs 基因和 4X 中 Cluster2 和 Cluster1 的 CrGSHs基因变化趋势相似，Cluster3的基因表达量在 Re 72h最高，Cluster4的基因表达量则在 Re 48h最高。6X 中 Cluster2的5个基因表达量变化不明显。4X的CrGSHs基因表达倍数略高于6X。
通过 KEGG 富集通路分析发现SOD 基因主要富集于过氧化物酶体相关通路中。如图6，C所示，4X和6X中的SOD 相关基因在低温胁迫及复温处理下其表达量有先下调再上调和先上调再下调2种变化趋势。4X 和6X 中 Cluster1的 CrSODs 基因表达量变化趋势相似，但4X 的 CrSODs 基因在胁迫72h后表达量最高，而6X 中则在 Re 48h表达量最高。4X中 Cluster2中的2个基因在0h时表达量最高，在胁迫后为下调表达，在复温期为上调表达，而6X中 Cluster2中的3个基因是在胁迫72h 后表达量最高。
图6抗氧化酶相关基因表达量热图
Fig.6Heat map of gene expressions associated with antioxidant enzymes
A.POD 相关基因; B.GSH 相关基因; C.SOD 相关基因。
A. POD-associated gene. B. GSH-associated gene. C. SOD-associated gene.
2.7 抗氧化酶活性与其关键基因表达量的相关性分析
将4X和6X 各时期均有的差异基因与抗氧化酶活性进行相关性分析。结果（表3）表明，4X 与抗氧化酶活性具显著正相关的基因有12个，极显著正相关有7个; 与 GSH 含量有显著相关性的基因有5 个，与POD活性有显著相关性的基因有7个。6X与抗氧化酶活性具显著正相关的基因有14个，显著负相关的基因有11个，其中极显著正相关有9个，极显著负相关有8个; 与 GSH 含量有显著相关性的基因有7个，5个为显著正相关，2个为显著负相关; 与 POD活性有显著相关性的基因有16个，其中9个为显著正相关，7个为显著负相关; 与SOD活性有显著相关性的基因有2个，均为显著负相关（表3）。
2.8 实时荧光定量PCR验证
对选取的 6 个基因进行 q-PCR 验证。如图7所示，6个基因的 qRT-PCR 表达趋势与 RNA-seq 结果基本一致，表明 RNA-seq结果可信度较高。
表3抗氧化酶活性与其关键基因表达量的相关性分析
Table3Correlation analysis between antioxidant enzyme activity and expression of key genes
注:*表示在0.05水平（双尾）相关性显著; **表示在0.01水平（双尾）相关性显著。
Note: * indicates the correlation is significant at the 0.05 level (double tailed) . ** indicates the correlation is significant at the 0.01 level (double tailed) .
图76个基因的定量表达分析
Fig.7Quantitative expression analysis of six genes
3 讨论
3.1 低温胁迫对2种倍性滇山茶幼苗叶片生理指标的影响
GSH 在生物合成途径、解毒、抗氧化生物化学和氧化还原稳态中起重要作用，GSH 的增强是植物抵抗寒冷胁迫的重要因素之一，因为植物的生存离不开谷胱甘肽或谷胱甘肽的同源物[20]。李进等[21] 在低温胁迫下棉花（Gossypium hirsutum）幼苗对 AsA-GSH 循环的响应试验中发现，棉花幼苗叶中 GSH 含量随着低温胁迫时间延长显著增加。毛轩雯等[22]发现经低温处理后‘宫粉’三角梅（Bougainvillea glabra Choisy）（强耐寒）的 GSH 含量高于同时期‘热火’（中耐寒）和‘百变’（弱耐寒）三角梅的含量。本研究结果与其不一致，可能是由于 6X 植物的 ATP水解受到冷胁迫的抑制，不可用 ATP 较高，导致 GSH 合成降低[23-24]。4X 的 GSH 相关基因表达量高于6X，并且4X 的 GSH 含量与其相关基因呈显著正相关，导致 4X 的 GSH 含量高于 6X。SOD、POD和 CAT 作为植物清除 H2O2 重要的酶，在缓解植物过氧化损伤、增强植物低温抗性方面发挥重要作用[25]。Qi等[26] 对甘蓝型油菜（Brassica napus）耐寒生理生化机制的研究发现，‘16NTS309’（高抗冷害）中 POD、SOD 和 CAT 活性较‘天优2238’（冷敏感）高。本研究发现，在低温胁迫期至复温期，6X 滇山茶中 SOD、POD 和 CAT 的活性比4X的高。
当植物处于低温逆境时，会导致细胞膜脂发生过氧化作用，膜内物质外渗并产生大量 MDA，从而影响一系列生理生化反应的正常进行，故可通过 MDA 含量变化分析膜系统受损程度以及植物的耐寒能力。章锦涛等[2]在低温胁迫下对不同品种山茶（C.japonica）生理生化指标的影响研究中发现，山茶的耐寒性与丙二醛含量成反比。在4X 和6X 滇山茶低温胁迫期至复温期中研究发现，4X滇山茶中积累的 MDA 量比6X的高，说明低温胁迫对6X 的伤害比4X小。
渗透调节物质 SS、SP 和 Pro的积累能够平衡在低温条件下的细胞代谢，对生物膜系统起到很好的保护作用，以抵御环境胁迫带来的不利影响[27]。孟诗原等[28]在低温胁迫条件下对5种卫矛属（Euonymus）植物进行抗寒性研究发现，卫矛属植物通过渗透调节物质的合成来提高细胞内的渗透势，从而提高植物对低温环境的适应能力。陈明辉等[29]对不同品种果蔗（Saccharum officinarum）的研究发现，SS、SP和 Pro含量随着低温胁迫时间的延长而持续升高。本研究发现在低温胁迫期至复温期，6X滇山茶的SS、SP和 Pro含量均比4X的高。
本研究对低温胁迫下4X 和6X 滇山茶的生理指标分析表明，6X较4X 能够更好地提高渗透调节物质含量和抗氧化酶活性，积累较低水平的 MDA，进而有效抵御 ROS带来的伤害，可以更好地适应低温环境，说明6X的抗寒能力比4X的强。
3.2 低温胁迫对2种倍性滇山茶叶片抗氧化酶基因表达的影响
Baek等[30]研究发现在低温条件下抗氧化酶活性的上调及其相关基因表达水平显著升高可以保护植物免受冷胁迫带来的伤害。本研究发现在低温胁迫及复温条件下，4X 和6X 滇山茶的 POD 和 SOD 活性总体上升，同时对低温胁迫下4X 和6X 的转录组数据分析发现，在胁迫期和复温期中，多数 CrPODs和CrSODs基因上调表达，且6X中的表达倍数明显大于4X。将低温胁迫和复温下的抗氧化酶活性与其相关基因表达进行相关性分析发现，在4X中 POD活性与其相关基因有5个极显著正相关，而在 6X中POD活性与其相关基因有7个极显著正相关，4个极显著负相关。SOD活性与其相关基因在4X中无显著相关性，而在6X中有2个CrSODs基因与其活性有极显著负相关。当4X 和6X 受到低温胁迫时，6X叶片干枯掉落程度较4X更弱，6X的耐低温表现比4X好，可能是由于4X中的CrPODs和CrSODs 基因对其酶活性的调控作用没有6X的强。
Alscher认为，植物体内 GSH 水平的提高不仅与植物对环境胁迫的忍耐有关，而且 GSH 含量的增加可能是植物对环境胁迫的内在响应之一[31]。 Yu等[32]在 ATP通过水解调节谷胱甘肽的可用能量来决定水稻（Oryza sativa）幼苗的耐寒性研究中表明，冷胁迫对 ‘RIL82’的损害大于 ‘ZZ39’，但 ‘RIL82’中GSH1 和GSH2 基因的表达水平显著高于‘ZZ39’，这可能是由于植物在冷胁迫下的能量状态所导致的。本研究结果与之一致，4X 和6X 滇山茶的 GSH 含量在低温胁迫期及复温期整体均有所增加，同时对2种倍性滇山茶转录组数据分析发现，在胁迫期至复温期中，多数GSH 相关基因上调表达，且4X 中的表达倍数略高于6X。将 GSH 含量与其相关基因进行相关性分析发现，在 4X 中 GSH 含量与其相关基因有2个极显著正相关，而在 6X 中 GSH 含量与其相关基因不仅有2个极显著正相关，还有2个极显著负相关，6X 中的CrGSHs 基因对其蛋白含量的负调控比4X 的多。说明在滇山茶低温胁迫应答中，GSH 相关基因可能通过对 GSH 含量进行调控，从而参与对低温应答的调控。
4 结论
在-4℃低温胁迫下，从叶片表型观测结果看，6X叶片受损程度相对比4X 较小，抗寒表现更佳; 从生理指标分析结果看，6X 比4X 能更好地增强抗氧化酶活性、提高渗透调节物质含量和积累较少的 MDA，这说明6X的抗寒能力比4X 的强; 从分子层面看，将差异表达基因与抗氧化酶活性进行相关性分析发现，GSH 和POD 相关基因在4X 滇山茶中对其活性的调控均为正向调控，而在6X 中既有正向调控也有负向调控，SOD 相关基因在4X 中与其活性无显著相关性，而在6X 中对其活性的调控为负向调控。低温胁迫下抗氧化酶活性变化与其相关差异基因的表达存在相关性，说明抗氧化酶基因可能通过对其活性进行调控，从而参与对低温应答的调控。
