摘要
【目的】 为探究TaRING1在小麦与条锈菌互作过程中的作用，解析其作用机理，为小麦条锈病的绿色防控提供理论依据。【方法】利用酵母双杂交技术筛选TaRING1的互作靶标蛋白，并通过荧火素酶互补实验(LCA)及双分子荧光互补(BiFC)验证互作，通过泛素化实验对TaRING1的泛素功能进行验证，通过烟草瞬时表达及小麦原生质体转化分析靶标TaRIP92的亚细胞定位。【结果】以TaRING1作为诱饵，利用酵母双杂交技术筛选到互作靶标TaRIP92，并通过LCA及BiFC验证TaRING1与TaRIP92互作，通过体外泛素化实验证明TaRING1可以泛素化底物TaRIP92，烟草瞬时表达及小麦原生质体转化发现TaRIP92蛋白定位于线粒体。【结论】TaRING1通过与线粒体蛋白TaRIP92互作并对其进行泛素化。
Abstract
[Objective] The study aims to explore the role of TaRING1 in the interaction between wheat and stripe rust, analyze its mechanism and provide theoretical basis for the green prevention and control of wheat stripe rust. [Methods] The interaction target proteins of TaRING1 were screened by yeast two-hybrid assays and verified by bimolecular fluorescence complementation (BiFC) and luciferase complementation (LCA) assays. The ubiquitylation function of TaRING1 was verified by ubiquitination analysis. The subcellular localization of target TaRIP92 was observed by transient expression in Nicotiana benthamiana and wheat protoplasts. [Results] Using TaRING1 as bait, the target protein TaRIP92 was screened by yeast two-hybrid, and the interaction between TaRING1 and TaRIP92 was verified by LCA and BiFC. In vitro ubiquitination assays proved that TaRING1 ubiquitinated TaRIP92. Transient expression in N. benthamiana and wheat protoplasts showed that TaRIP92 was localized in mitochondria. [Conclusion] TaRING1 interacts with and ubiquitinates the mitochondrial protein TaRIP92.
Keywords
小麦（Triticum aestivum L.）作为世界上重要的粮食作物之一，有接近2.2×108 hm2的种植面积，也是人类主要的食物来源[1]。小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f. sp. tritici，Pst）引发的影响小麦生产的严重病害之一。据有关统计，全球80%以上的小麦种植区域都爆发过小麦条锈病，导致全球每年21 840 hm2的小麦遭受小麦条锈病的侵染，给小麦生产带来巨大的经济损失[2]。因此，开展小麦条锈病防控，解析小麦与条锈菌互作的分子机制对于保证全球粮食安全具有重要意义。
植物在受到病原菌侵染时会触发免疫反应，研究发现E3泛素连接酶在植物的ETI和PTI信号转导中发挥作用[3]。泛素/26S蛋白酶体（UPS）途径是一种重要的蛋白质翻译后修饰作用，主要发生在真核生物细胞中，可以使植物更好地适应外界自然环境，促进植物生长发育[4]。目前为止，植物中已有近百个R基因被克隆，其中一些基因所涉及的抗病信号途径与泛素化相关[5]。了解用于识别特异性底物的E3泛素连接酶的功能对于解析植物细胞中复杂而有序的调控机制有重要意义。研究发现拟南芥RING型E3泛素连接酶RIN2和RIN3作用于调节RPM1和RPS2依赖的过敏性坏死反应的底物来调控植物免疫[6]。小麦E3泛素连接酶TaSDIR1-4A也是一种RING-H2型蛋白，具有E3连接酶功能，其介导膜结合转录因子TaWRKY29的泛素化降解，进而增强小麦抗旱性[7]。在研究水稻稻瘟病效应子与抗病蛋白互作中发现APIP6是1个RING型E3泛素连接酶，干扰APIP6基因的表达导致抗病相关基因的下调表达，活性氧含量降低，对稻瘟病的抗性减弱[8]。胡椒中1个E3泛素连接酶CaRING1，包含1个C端RING结构域，沉默CaRING1基因的表达，抗病相关基因下调表达，水杨酸含量显著降低，植株的抗病性减弱[9]。
该研究组前期筛选到小麦条锈菌效应蛋白Hasp172，其在条锈菌侵染早期抑制寄主小麦的免疫反应，并通过酵母双杂交筛选到Hasp172的互作靶标蛋白TaVDAC1（voltage-dependent anion channel），进一步发现TaVDAC1与小麦RING型E3泛素连接酶TaRING1互作。为深入了解TaRING1调控小麦免疫反应的分子机理，通过酵母双杂交实验筛选到互作靶标TaRIP92（TaRING1 Interacting Protein 92），并利用双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）及荧火素酶互补（luciferase complementation assay，LCA）实验验证TaRING1与TaRIP92互作，体外泛素化实验证明TaRING1可以泛素化TaRIP92，TaRIP92定位在线粒体中。该研究通过揭示小麦E3泛素连接酶TaRING1调控底物TaRIP92泛素化的作用机理为小麦条锈病的绿色防控提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
试验材料为小麦水源11、本氏烟草（Nicotiana benthamiana），酵母菌株Y2HGold，农杆菌菌株GV3101，小麦生长于16℃光照16 h，12℃黑暗8 h的光16 h（16℃）/暗8 h（12℃）的光暗交替培养箱中，本氏烟草在25℃人工气候室培养，载体有pGADT7、pGBKT7、pBIN、pCAMBIA1300-nLuc、pCAMBIA1300-cLuc、pMDC-163、pSPYCE、pSPYNE、pMAL-c5X、pGEX-4T-1。
1.2 载体构建
研究组前期通过TaVDAC1酵母双杂交筛选得到互作靶标TaRING1，通过NCBI网站获得TaRING1的基因序列，酵母双杂交筛选到TaRING1互作靶标TaRIP92，用Primer 5设计引物，引物由擎科生物公司合成（表1），用同源重组法构建pGBKT7-TaRING1、pGADT7-TaRING1、pGBKT7-TaRIP92、pGBKT7-TaRIP17、pGBKT7-TaRIP18、pGBKT7-TaRIP114、pGBKT7-TaRIP140、pGBKT7-TaRIP168、pCAMBIA1300-nLuc-TaRIP92、pCAMBIA1300-cLuc-TaRING1、pBIN-TaRIP92、pSPYNE-TaRIP92、pSPYCE-TaRING1、pMDC-163-TaRIP92、pMAL-c5X-TaRING1、pGEX-4T-1-TaRIP92重组载体。
1.3 酵母双杂交系统筛选互作靶标
将构建好的pGBKT7-TaRING1重组质粒转化酵母菌株Y2HGold，将pGADT7空质粒转化含有TaRING1的酵母菌中，将转化的菌液涂布在SD-W-L（-Trp/-Leu）培养基和SD-W-L-H（-Trp/-Leu/-His）培养基，30℃培养箱放置3 d，观察其能否在SD-W-L培养基和SD-W-L-H培养基生长，进行酵母自激活验证；进一步将含有TaRING1酵母菌液转接10 mL SD-W（-Trp）液体培养基，30℃ 200 r/min摇床培养24 h，再次转接至150 mL SD-W液体培养基，30℃ 200 r/min摇床培养5~8 h，OD600为0.6左右，制作酵母感受态细胞，转化小麦与条锈菌互作的小麦cDNA文库，将转化完成的菌液涂布于SD-W-L-H（-Trp/-Leu/-His）的培养基，30℃培养箱放置3 d，挑取单菌落于SD-W-L-H-A（-Trp/-Leu/-His/-Ade）培养基，培养3~4 d后，进行菌落PCR，PCR产物送测序；测序结果使用NCBI数据库进行BLAST序列比对，挑选候选靶标，进一步设计引物扩增靶标的CDS序列，连接pGADT7载体，进行酵母回复验证[10]。
表1PCR引物名称及序列
Table1Names and sequences of PCR primers
1.4 荧火素酶互补实验（LCA）
将构建好的重组载体pCAMBIA1300-nLuc-TaRIP92、pCAMBIA1300-cLuc-TaRING1以及空载体pCAMBIA1300-nLuc、pCAMBIA1300-cLuc分别转化农杆菌感受态GV3101，挑取单菌落于10 mL液体LB培养基中，28℃ 220 r/min摇床培养24 h，6 000 r/min离心2 min收菌，10 mmol/L MgCl2重悬菌液，重复2次，0.05 mol/L乙酰丁香酮稀释至OD600为0.5，将菌液混合后注射本氏烟草叶片，40 h后，将烟草叶片均匀涂抹显色底物，黑暗反应4 min，用多光谱动态荧光显微成像系统进行观察并拍照[11]。
1.5 双分子荧光互补（BiFC）
将构建好的重组载体pSPYNE-TaRIP92、pSPYCE-TaRING1以及空载体pSPYNE、pSPYCE分别转化农杆菌感受态GV3101，挑取单菌落于10 mL液体LB培养基中，28℃ 220 r/min摇床培养24 h，6 000 r/min离心2 min收菌，10 mmol/L MgCl2重悬菌液，重复2次，0.05 mol/L乙酰丁香酮稀释至OD600为0.5，将菌液混合后注射本氏烟草叶片，40 h后用激光共聚焦显微镜FV 3000观察荧光并拍照[12]。
1.6 TaRIP92的亚细胞定位
将构建的pBIN-TaRIP92重组载体转化农杆菌感受态GV3101，挑取单菌落于10 mL液体LB培养基中，28℃摇床培养24 h，6 000 r/min离心2 min收菌，10 mmol/L MgCl2重悬菌液，重复2次，0.05 mol/L乙酰丁香酮稀释至OD600为0.5，注射本氏烟草叶片，36 h后用FV 3000激光共聚焦显微镜观察烟草叶片中荧光蛋白的定位。制备小麦原生质体，并将构建好的pMDC-163-TaRIP92重组载体及pMDC-163空载体分别转化小麦原生质体[13]，用FV 3000激光共聚焦显微镜观察小麦原生质体中荧光蛋白的定位。
1.7 体外泛素化反应
将构建好的pMAL-c5X-TaRING1、pGEX-4T-1-TaRIP92重组载体转化大肠杆菌BL21，进行原核表达，尝试不同的IPTG浓度和温度进行小量诱导，确定合适的温度和IPTG浓度后大量诱导，获得目的蛋白，进行SDS-PAGE。将诱导后的蛋白进行纯化，TaRING1-MBP融合蛋白用0.01 mo/L PBS配制的10 mmol/L麦芽糖洗脱目的蛋白；TaRIP92-GST融合蛋白用0.01 mol/L Tris-HCl（pH=7.5）配制的20 mmol/L还原型谷胱甘肽（pH=8.0）洗脱目的蛋白。获得纯化蛋白后使用索莱宝的Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。
进一步使用优碧生物体外泛素化试剂盒进行体外泛素化实验，底物泛素化体系如表2所示，分别制备缺失E1、E2、E3作为阴性对照。将混合的样品加入200 μL PCR管中，37℃金属浴反应7 h。反应结束后在各体系中加入5 μL的5×SDS-PAGE Buffer（加入1 μL新鲜配制的1 mol/L DTT），95℃反应5 min，吸取10 μL进行SDS-PAGE，随后进行蛋白免疫印迹（Western blot）分析。
表2底物泛素化体系
Table2Reaction components of substrate ubiquitination assays
2 结果与分析
2.1 TaRING1基因序列分析
分析小麦E3连接酶TaRING1的基因序列，发现其编码297个氨基酸，等电点为4.46，分子质量为31.10 kD；TargetP-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-2.0）预测TaRING1可能定位于线粒体中；用http://smart.embl-heidelberg.de/在线预测TaRING1的N端有1个zinc-ribbon结构域（24-59氨基酸），C端有1个RING-finger结构域（161-201氨基酸）。
2.2 TaRING1互作靶标的筛选及回复验证
为研究小麦E3泛素连接酶TaRING1的调控作用，筛选TaRING1的互作靶标。首先对TaRING1进行自激活验证，发现其不存在自激活作用；其次，将小麦与条锈菌互作的小麦cDNA文库质粒转入含有pGBKT7-TaRING1的酵母菌株中，筛选得到136个测序结果，酵母双杂交筛选部分靶标及功能注释如表3所示。
从中挑选出6个候选靶标进行验证，扩增6个靶标基因序列，连接pGBKT7载体，将其分别转入含有TaRING1的酵母菌株，发现其都能够在SD-W-L培养基生长，表明6个重组质粒均转化成功，只有TaRIP92能够在SD-W-L-H-A培养基上生长，且能够在SD-W-L-H-A+X-α-Gal培养基上显蓝（图1），表明TaRIP92蛋白与小麦E3泛素连接酶TaRING1互作。因此，将TaRIP92作为靶标进行后续研究。
表3酵母双杂交筛选的部分靶标及功能注释
Table3Target proteins screened by yeast two-hybrid and functional annotation
图1酵母双杂交验证TaRING1和TaRIP92互作
Fig.1Interaction between TaRING1 and TaRIP92 was verified by yeast two-hybrid assays
2.3 荧火素酶互补实验（LCA）验证TaRING1与TaRIP92互作
为了进一步确定TaRING1与TaRIP92的互作关系，用荧火素酶互补实验（LCA）进行互作验证，将重组载体pCAMBIA1300-nLuc-TaRIP92、pCAMBIA1300-cLuc-TaRING1以及空载体pCAMBIA1300-nLuc、pCAMBIA1300-cLuc分别转化农杆菌感受态，过夜摇菌，并处理菌液OD600为0.5，设置pCAMBIA1300-nLuc（nLuc）与pCAMBIA1300-cLuc（cLuc）、pCAMBIA1300-nLuc（nLuc）与pCAMBIA1300-cLuc-TaRING1（TaRING1-cLuc）、pCAMBIA1300-cLuc（cLuc）与pCAMBIA1300-nLuc-TaRIP92（TaRIP92-nLuc）为对照组，pCAMBIA1300-cLuc-TaRING1（TaRING1-cLuc）与pCAMBIA1300-nLuc-TaRIP92（TaRIP92-nLuc）为实验组，分别注射本氏烟草叶片背面4个部分，发现仅有TaRIP92-nLuc与TaRING1-cLuc的组合出现荧光，阴性对照无荧光（图2），表明小麦泛素E3连接酶TaRING1与TaRIP92互作。
2.4 双分子荧光互补（BiFC）验证TaRING1与TaRIP92互作
将重组载体pSPYNE-TaRIP92、pSPYCE-TaRING1以及空载体pSPYNE、pSPYCE分别转化农杆菌感受态，过夜摇菌，并处理菌液浓度OD600为0.5，设置实验组为YNE-TaRIP92+YCE-TaRING1，对照组为YNE+YCE-TaRING1、YCE+YNE-TaRIP92、YNE+YCE及阳性对照，注射烟草叶片，发现仅有YNE-TaRIP92+YCE-TaRING1组合和阳性对照出现了荧光（图3），进一步表明TaRING1与TaRIP92互作。
图2LCA验证TaRING1与TaRIP92互作
Fig.2TaRING1 interacts with TaRIP92 verified by LCA
图3BiFC验证TaRING1与TaRIP92互作
Fig.3TaRING1 interacts with TaRIP92 verified by BiFC
2.5 TaRIP92定位在线粒体
为了探究TaRIP92的定位情况，将pBIN和pBIN-TaRIP92重组载体分别转化农杆菌感受态，注射烟草叶片，用FV 3000激光共聚焦显微镜观察烟草叶片中荧光蛋白的定位，发现其定位在线粒体中（图4，A），进一步将pBIN-TaRIP92与CD3-991载体（mitochondrion marker）共侵染本氏烟草表皮细胞，结果（图4，B）显示TaRIP92与mito-CD991共定位，表明TaRIP92定位于线粒体。为了进一步探究其在小麦细胞中的定位，制备小麦原生质体，转化重组载体pMDC-163-TaRIP92及空载体pMDC-163，观察TaRIP92在小麦原生质体中的定位，实验结果（图4，C）表明TaRIP92定位在线粒体。综上所述，TaRIP92定位于线粒体。
图4TaRIP92的亚细胞定位
Fig.4Subcellular localization of TaRIP92
A. TaRIP92在烟草中的亚细胞定位，标尺为10 μm；B. TaRIP92与CD3-991（mitochondrion marker）在烟草中共定位， CD3-991为线粒体marker，发红色荧光，标尺为20 μm；C. TaRIP92在小麦原生质体中的亚细胞定位，标尺为5 μm。
A. Subcellular localization of TaRIP92 in N. benthamiana, bar=10 μm. B. TaRIP92 and CD3-991 (mitochondrion marker) were co-localized in N. benthamiana. CD3-991 is a mitochondrial marker with red fluorescence, bar=20 μm. C. Subcellular localization of TaRIP92 in wheat protoplasts, bar=5 μm.
2.6 TaRING1泛素化TaRIP92
为了探究小麦E3泛素连接酶TaRING1是否泛素化TaRIP92。首先诱导TaRIP92-GST蛋白表达，进行蛋白纯化；使用体外泛素化试剂盒，ATP提供能量，小麦E1，UBE2D1、泛素分子（Ubiquitin）及TaRING1-MBP（E3）蛋白存在的条件下，进行底物泛素化反应7 h后，进行western blot发现在E1、E2[20×UBE2D1/UbcH5a（D1）]、Ubiquitin、TaRING1-MBP（E3）蛋白及TaRIP92-GST蛋白都存在的泳道观察到了1条弥散的大分子复合物（图5），表明小麦E3泛素连接酶TaRING1-MBP可以泛素化底物TaRIP92-GST，形成大分子（Ubi）n-TaRIP92-GST复合物，而阴性对照不能观察到泛素化，表明小麦E3泛素连接酶TaRING1可以对TaRIP92进行泛素化修饰。
图5TaRING1泛素化底物TaRIP92
Fig.5TaRING1 ubiquitinylates the substrate TaRIP92
TaRIP92-GST和TaRING1-MBP共同孵育进行体外泛素化反应，反应产物用anti-GST进行western blot检测。
TaRIP92-GST and TaRING1-MBP were incubated for ubiquitination assay in vitro, the western blot was performed using anti-GST antibody
3 讨论
研究表明E3泛素连接酶在多种植物中参与抗病及感病调控，在植物与病原菌互作中发挥重要作用。泛素化过程是由泛素激活酶E1、泛素结合酶E2及泛素连接酶E3所参与的级联反应，E1、E2相对比较保守，E3泛素连接酶因其对底物的特异性识别作用种类繁多，因此解析小麦E3泛素连接酶的作用机理，对小麦条锈病的绿色防控具有重要意义。
拟南芥中1个RING型E3泛素连接酶MIEL能够与转录因子MYB30发生相互作用，并且促进MYB30的降解，从而减弱MYB30发挥的抗病作用[14]。水稻中1个E3泛素连接酶OsSIRP2也通过酵母双杂交实验筛选到互作靶标OsTKL1，且发现OsSIRP2受到逆境胁迫与OsTKL1发生互作并泛素化OsTKL1，并通过26S蛋白酶体途径增强OsTKL1的降解，增强水稻对逆境胁迫的耐受性[15]。表明E3泛素连接酶可能通过调控互作靶标影响植物的抗逆性，本研究筛选TaRING1互作靶标TaRIP92，并通过BiFC和LCA验证两者互作，然而TaRING1是否通过与TaRIP92互作影响小麦的抗病性仍需进一步研究，为后续解析小麦E3泛素连接酶TaRING1的分子机制及生物学功能奠定了理论基础。
通过烟草瞬时表达及小麦原生质体转化发现TaRIP92特异定位在线粒体，表明线粒体可能是TaRIP92发挥功能的主要场所，在水母雪莲[16]和二穗短柄草[17]中也通过瞬时表达系统对相关蛋白的定位进行研究。研究表明，线粒体在植物生长发育及植物对逆境胁迫响应发挥重要作用[18]，拟南芥氰丙氨酸合成酶-线粒体CYS-C1基因通过影响ROS的积累及调控水杨酸代谢途径影响对病原菌的抗性[19]。蛋白质的亚细胞定位与其发挥的生物学功能密切相关，然而TaRIP92在线粒体如何发挥作用仍需进一步研究，本研究对TaRIP92亚细胞定位的分析为其功能研究提供了理论基础。
体外泛素化实验证明TaRING1可以泛素化修饰TaRIP92，有研究表明小麦泛素连接酶TaGW2能够泛素化TaARR12，促进小麦对干旱胁迫的反应[20]，表明泛素化可能对于小麦的逆境反应产生影响，然而泛素化TaRIP92是否对小麦植株的抗病性产生影响，后续要通过过表达及基因编辑实验进行验证，本研究初步解析了TaRING1作用的分子机制，为小麦条锈病的绿色防控奠定理论基础。
4 结论
研究利用酵母双杂交技术筛选小麦E3泛素连接酶TaRING1互作靶标TaRIP92，通过荧火素酶互补实验（LCA）及双分子荧光互补（BIFC）验证两者互作，泛素化实验表明小麦E3泛素连接酶TaRING1能够泛素化TaRIP92，烟草瞬时表达及小麦原生质体转化表明TaRIP92定位在线粒体。
