蓖麻ZF-HD基因家族鉴定及表达模式分析
doi: 10.7606/j.issn.1000-4025.20240312
徐兴源1 ， 黄凤兰2,3,4,5,6 ， 张春兰2 ， 朱梦洋1 ， 崔志宇1 ， 刘鹏1,6
1. 内蒙古民族大学 农学院，内蒙古通辽 028000
2. 内蒙古民族大学 生命科学与食品学院，内蒙古通辽 028000
3. 蓖麻育种国家民委重点实验室，内蒙古通辽 028000
4. 内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心，内蒙古通辽 028000
5. 内蒙古自治区蓖麻育种与综合利用重点实验室，内蒙古通辽 028000
6. 蓖麻产业技术创新内蒙古自治区工程研究中心，内蒙古通辽 028000
基金项目: 国家自然科学基金项目(31860389) ； 蓖麻产业技术创新内蒙古自治区工程研究中心开放基金项目(MDK2023010) ； 内蒙古自治区蓖麻产业协同创新中心开放基金项目(MDK2023078) ； “内蒙古自治区草原英才工程创新团队-蓖麻分子育种研究创新人才团队”滚动支持计划项目
Identification and expression analysis of the ZF-HD gene family in castor
XU Xingyuan1 ， HUANG Fenglan2,3,4,5,6 ， ZHANG Chunlan2 ， ZHU Mengyang1 ， CUI Zhiyu1 ， LIU Peng1,6
1. College of Agriculture, Inner Mongolia Minzu University, Tongliao, Inner Mongolia 028000 , China
2. College of Life Sciences and Food Engineering, Inner Mongolia Minzu University, Tongliao, Inner Mongolia 028000 , China
3. Key Laboratory of Castor Breeding of the State Ethnic Affairs Commission, Tongliao, Inner Mongolia 028000 , China
4. Inner Mongolia Industrial Engineering Research Center of Universities for Castor, Tongliao, Inner Mongolia 028000 , China
5. Inner Mongolia Key Laboratory of Castor Breeding and Comprehensive Utilization, Tongliao, Inner Mongolia 028000 , China
6. Castor Industry Technology Innovation Inner Mongolia Autonomous Region Engineering Research Center, Tongliao, Inner Mongolia 028000 , China
摘要
【目的】 对蓖麻ZF-HD家族基因进行鉴定，并对其成员进行序列分析、系统进化分析、启动子及表达模式分析，为进一步研究蓖麻中ZF-HD基因的功能提供参考。【方法】以蓖麻全基因组数据为基础，从中鉴定出ZF-HD基因，并进行生物信息学分析和非生物胁迫下的表达分析。【结果】从蓖麻中共鉴定到13个ZF-HD基因家族成员，该基因家族成员不均匀分布在Chr1-Chr10上，13个RcZF-HD蛋白均为亲水性不稳定蛋白，亚细胞定位于细胞核。RcZF-HD基因家族聚类为3个亚簇，且每簇基因数不同，基因结构具有簇内保守性和簇间多样性。RcZF-HD基因家族成员具有大量组织特异性元件、应激响应元件和激素响应元件。ZF-HD基因广泛响应非生物胁迫，且表达具有组织特异性。【结论】在蓖麻中一共鉴定出13个ZF-HD基因。研究发现蓖麻ZF-HD基因家族成员在应对非生物胁迫时起重要作用，能够为蓖麻的抗逆性研究提供一定的理论依据。
Abstract
[Objective] The ZF-HD family genes of castor were identified and analyzed by sequence analysis, phylogenetic analysis, promoter and expression pattern analysis, to provide a reference for further study of the function of ZF-HD genes in castor. [Methods] Based on the whole genome data of castor, ZF-HD genes were identified, and bioinformatics and expression analysis under abiotic stress were carried out. [Results] A total of 13 ZF-HD genes were identified from castor, which were unevenly distributed on Chr1-Chr10. All 13 RcZF-HD proteins were hydrophilic unstable proteins, and were localized in the nucleus. The RcZF-HD genes were clustered into three subgroups, and the number of genes in each group was different. The gene structure was conserved within the group but diversified between groups. RcZF-HD genes had a large number of tissue-specific elements, stress response elements, and hormone response elements. The ZF-HD genes were widely responsive to abiotic stresses and their expression was tissue-specific. [Conclusion] A total of 13 ZF-HD genes were identified in castor. It is known that members of the castor ZF-HD gene family play an important role in responding to abiotic stress, this research provides theoretical basis for the study of castor's stress resistance.
蓖麻（Ricinus communis）因极高的经济与科研价值而闻名，非生物胁迫严重影响蓖麻的品质与产量，例如，低温、干旱、高盐等胁迫。除了可通过提高栽培技术、改良土壤以及利用新的滴灌技术等方法适应非生物胁迫提高品质与产量外，抗逆品种的选育以及推广也是一项十分重要的选择[1]。蓖麻基因组测序的完成为蓖麻在基因组层面上对抗逆研究以及耐逆品种选育提供便利。在植物抗逆研究中发现，转录因子可通过与自身之间或与其他蛋白质之间相互作用激活或抑制相关基因表达，进而调控植物在非生物胁迫中的适应性，从而提高植物在非生物胁迫环境中的适应能力[2-3]。
ZF-HD（zinc-finger homeodomain）转录因子具有与靶基因启动子特定区域结合的特性，在植物的生长发育、抗逆性和信号转导中发挥重要作用[4-6]。ZF-HD蛋白包含保守的ZF-HD-dimer结构域（PF04770），该结构域由富含半胱氨酸的锌指（ZF）结构域和保守的同源（HD）结构域组成[7]。锌指结构域ZF广泛存在于能与DNA或RNA特异结合的多种调节蛋白中，进而能参与蛋白质与蛋白质之间的互作，以增强或抑制转录[8]。HD结构域作为DNA的结合区域，其氨基酸可作为识别螺旋从而特异地与DNA结合以激活或抑制靶基因的表达[9]。ZF-HD基因家族首次在黄顶菊[Flaveria bidentis（L.）Kuntze.]中被发现[10]，随后在多种植物中相继报道了ZF-HD基因，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）[11]、番茄（Solanum lycopersicum）[12]、玉米（Zea mays L.）[13]、白菜（Brassica rapa var. glabra Regel）[14]等。研究结果表明，植物ZF-HD基因在植物的生长发育以及在非生物胁迫中均发挥重要作用[15]。据报道，过表达AtZF-HD5基因的植物表现出更大的叶[16]。AtZF-HD08在花器官中高度表达，在花发育中起重要作用[11]。在番茄和苦荞（Fagopyrum tataricum）中的SlZF-HD7和FtZF-HD1同样在叶和花发育中起重要作用[17-18]。另外，拟南芥中多个ZF-HDs参与逆境应激反应[19]，在番茄[12]和小麦（Triticum aestivum L.）[20]中也有类似发现。AtZF-HD1过表达增强了拟南芥的抗旱能力[21]。番茄中SlZF-HD13沉默后番茄的耐盐性和耐旱性均有所下降[22]。然而，蓖麻ZF-HD基因家族成员鉴定以及相关研究鲜见报道。文章鉴定蓖麻ZF-HD基因家族成员，并分析蓖麻ZF-HD基因家族成员的基因结构和基因表达模式等，为后续深入研究RcZF-HD基因功能，如调控蓖麻生长发育和响应非生物胁迫以及蓖麻的抗逆育种研究提供理论参考。
1 材料和方法
1.1 试验材料
供试蓖麻品种为通辽市农牧科学研究所选育的‘通蓖5号’，由内蒙古民族大学种质资源实验室扩繁并保存。试验所用的各种试剂盒（荧光定量检测、总RNA提取、高保真Taq酶Mix和cDNA反转录）均为赛默飞世尔科技公司产品。其他化学试剂均由北京沃凯生物科技有限公司提供。试验所需引物均交由上海生工生物有限公司合成，序列见表1。主要设备仪器：T100TMPCR仪（Bio-Rad，美国）、 LightCycler® 480 Ⅱ 型荧光定量PCR仪（Rotkreuz，瑞士）。
表1引物序列
Table1Primer sequences
1.2 试验方法
1.2.1 样品处理及采集
选取籽粒饱满，大小、光泽和斑纹一致的蓖麻籽作种子。精选的种子经28℃催芽处理后将其均匀摆放在发芽盒中进行水培，待2片子叶展开后浇灌1/2的MS营养液，待2片真叶完全展开后浇灌1/2 Hoagland营养液。4叶期时分别进行干旱（10% PEG 6000）胁迫处理。胁迫后的6 h、12 h、24 h、36 h为试验组，各时间段未胁迫处理的为对照组，剪取对照组的根、茎、子叶、真叶和试验组的根、真叶，液氮速冻后放置于-80℃冰箱中保存备用。
1.2.2 总RNA提取
将蓖麻组织放入到高温灭菌且预冷后的研钵内，迅速加入液氮，充分磨成粉末状。按照TransZol试剂说明书提取蓖麻总RNA。使用第一链cDNA试剂盒反转录合成第一链cDNA，合成体系包括模板RNA 5 μL，MonScriptTM 5×RTlll All-in-One Mix 4 μL，MonScriptTM dsDNase1 μL，Nuclease-Free Water补足至20 μL。合成条件：37℃反应2 min，56℃反应15 min，85℃反应2 min。
1.2.3 实时荧光定量PCR
依据RcZF-HD01和RcZF-HD07序列信息设计引物，如表1所示。将蓖麻的Actin基因作为内参基因，通过qRT-PCR分析RcZF-HD01和RcZF-HD07基因在干旱胁迫处理下的表达模式。反应体系：第一链cDNA 1 μL，SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，正反向引物各0.5 μL，ddH2O补足至20 μL。使用LightCycler® 480 Ⅱ 型荧光定量PCR仪进行qRT-PCR反应。反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行40个循环。
1.2.4 统计分析
每个处理进行3次生物学重复和3次技术重复，依据2-ΔΔCT方法计算基因表达量的差异倍数关系，使用Excel整理数据，SPSS 2.0软件计算样本间的显著差异性（P＜0.05）。
1.2.5 蓖麻RcZF-HD家族成员筛选与理化性质分析
从油料作物数据库（http://oilplants.iflora.cn/）获取蓖麻的基因组序列文件、蛋白质序列文件和基因组注释文件。在NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中获得拟南芥ZF-HD家族蛋白质序列做为靶标序列进行本地 BLASTp比对；并使用HMMER软件，以PF04770模型检索出含有该结构域的蛋白质序列。结合BLASTp和HMMER的结果，删除冗余序列后将获取的蛋白序列上传到NCBI-CD SEARCH 和SMART（https://smart.embl-heide-lberg.de/）网站，确保所筛选的蓖麻ZF-HD蛋白质序列准确，最终得到13个蓖麻RcZF-HD基因家族成员。蓖麻RcZF-HD基因家族成员的理化性质分析在ExPASy网站（https://web.expasy.org/）完成。用WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）预测RcZF-HD的亚细胞位置。RcZF-HD蛋白质的磷酸化位点预测在NetPhos 3.1（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）网站完成。
1.2.6 蓖麻RcZF-HD基因家族成员的高级结构、系统进化和基因结构分析
RcZF-HD蛋白质的二级和三级结构预测分别使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org/）在线网站完成，再由SAVESv6.0（https://saves.mbi.ucla.edu/）在线工具对三级结构模型打分。
使用MEGA 11.0软件对RcZF-HD蛋白质构建进化树。用MEME（https://meme-suite.org/meme/doc/meme.html）在线软件预测RcZF-HD蛋白质的保守基序，最大基序（motif）数量设置为10，其他参数默认。用Tbtools软件完成基因结构和保守基序的可视化。
1.2.7 蓖麻RcZF-HD基因家族在染色体上的定位分析及RcZF-HD启动子的顺式作用元件分析
利用Tbtools软件提取出RcZF-HD基因家族成员在染色体上的位置信息并进行可视化处理。
将从基因组中获取的RcZF-HD基因转录起始上游1 500 bp序列，提交至PlantCare（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测RcZF-HD启动子顺式作用元件的组成。
1.2.8 蓖麻与拟南芥、水稻以及橡胶树物种间RcZF-HD蛋白质聚类分析
将蓖麻ZF-HD家族蛋白序列上传至NCBI中进行BLAST比对分析，并下载水稻、橡胶树、拟南芥ZF-HD家族蛋白序列，把拟南芥、水稻、橡胶树的ZF-HD蛋白质序列和蓖麻的RcZF-HD蛋白质序列整合到同一个文件中，然后用MEGA 11.0 软件构建进化树，将结果提交到iTol（https://itol.embl.de）工具中进行美化处理。
1.2.9 蓖麻RcZF-HD基因家族成员表达模式分析
从RNA-Seq数据中查找出RcZF-HD基因胁迫的表达量数据和组织表达量数据。将上述得到的数据提交到Tbtools软件上进行可视化处理。
2 结果与分析
2.1 蓖麻RcZF-HD家族成员信息及理化性质
在全基因组中共筛选到13个ZF-HD基因家族成员，根据其在染色体的位置依次命名为RcZF-HD01-RcZF-HD13，并对蓖麻RcZF-HD家族成员进行理化性质分析（表2）。RcZF-HD家族成员的氨基酸数量有所不同，为95~335 aa；蛋白质分子质量为10.40~37.26 kD；等电点为5.90~9.40，仅RcZF-HD11为酸性蛋白质（pI＜7）；脂溶性系数为43.31~61.95；RcZF-HDs蛋白质均为亲水性不稳定性蛋白质；RcZF-HDs蛋白质均定位于细胞核中。RcZF-HDs蛋白质的磷酸化位点预测结果（图1）表明，潜在的丝氨酸磷酸化位点数为8（RcZF-HD06、RcZF-HD08）~30（RcZF-HD01）个，苏氨酸磷酸化位点数目为3（RcZF-HD06）~13（RcZF-HD07）个，酪氨酸磷酸化位点数为0（RcZF-HD07）~5（RcZF-HD01）个。RcZF-HDs蛋白质的二级结构（表3）与三级结构（图2）均表明RcZF-HD基因家族成员主要以无规则卷曲为主，其次是α-螺旋。
表2蓖麻RcZF-HD基因家族成员的基本信息
Table2Basic information about castor RcZF-HD gene family members
表3蓖麻RcZF-HD蛋白质的二级结构
Table3Secondary structure of the RcZF-HD proteins of castor
图1蓖麻RcZF-HD蛋白质的磷酸化位点
Fig.1Phosphorylation sites of castor RcZF-HD proteins
图2蓖麻RcZF-HD蛋白质的三级结构
Fig.2Tertiary structure of the RcZF-HD proteins of castor
2.2 蓖麻RcZF-HD基因家族成员系统进化、保守基序和基因结构分析
对13个RcZF-HD基因家族成员进行系统进化、保守基序和基因结构分析，结果（图3）显示，RcZF-HD基因家族成员被划分为3个亚簇。较多的RcZF-HD基因家族成员被归于Group Ⅰ中，有10个成员。只有1个RcZF-HD基因家族成员归类于Group Ⅲ之中。Motifs和结构域预测结果显示，motif 1-motif 10 在RcZF-HD蛋白质中保守，除RcZF-HD13外其余RcZF-HDs均含有motif 1、motif 3，表明这些蛋白在功能上具有相似性。此外RcZF-HDs均含有ZF-HD家族成员特有的ZF-HD-dimer结构域。综上所述，基序和结构域在不同Group分布的多样性预示RcZF-HD蛋白质在功能上具有多样性。蓖麻RcZF-HD的基因结构图显示这些基因结构有差异，同处于Group Ⅰ的RcZF-HD03与RcZF-HD11，RcZF-HD01、RcZF-HD10与RcZF-HD12，RcZF-HD02与RcZF-HD07基因的内含子组成及分布相似，说明这些基因之间的进化保守。
图3蓖麻RcZF-HD基因家族成员系统进化和基因结构分析
Fig.3Phylogenetic evolution and gene structure analysis of RcZF-HD genes in castor
2.3 蓖麻RcZF-HD基因在染色体上的位置分析
蓖麻RcZF-HD基因家族在染色体上定位（图4）显示，蓖麻RcZF-HD基因家族无规则地散乱分布在8条染色体上。其中RcChr2与RcChr5上分布较多的RcZF-HD家族基因均有3个RcZF-HD家族成员。RcChr9上分布2个RcZF-HD基因，而RcChr1、RcChr3、RcChr4、RcChr8和RcChr10上面仅有1个RcZF-HD基因。
深入分析发现在Chr5上存在基因重复现象，RcZF-HD07与RcZF-HD08基因重复，基因间的重复现象可能是由于基因家族成员间功能与表达模式相似。另外，RcZF-HD01和RcZF-HD06；RcZF-HD01和RcZF-HD07；RcZF-HD03和RcZF-HD11；RcZF-HD04和RcZF-HD09；RcZF-HD06和RcZF-HD07；RcZF-HD06和RcZF-HD13等之间均存在基因片段复制现象。
2.4 蓖麻与水稻、橡胶树、拟南芥ZF-HD家族成员间的聚类分析
对蓖麻、水稻、橡胶树、拟南芥ZF-HD家族蛋白序列进行系统进化分析，结果如图5所示。
图4蓖麻RcZF-HD基因家族在染色体上的定位分析
Fig.4Mapping analysis of RcZF-HD genes on chromosomes in castor
图5蓖麻与水稻、橡胶树、拟南芥ZF-HD基因家族成员间的聚类分析
Fig.5Cluster analysis of ZF-HD genes among R. communis, O. sativa, H. brasiliensis, and A. thaliana
ZF-HD家族蛋白序列共聚类为6个亚簇，其中Group Ⅰ含有ZF-HD家族成员数量最多为20个，其中RcZF-HDs成员有3个，HbZF-HDs成员有11个，AtZF-HDs成员有6个。Group Ⅵ含有的ZF-HD家族的物种与数量最少，仅有7个，均为OsZF-HDs成员。结果表明蓖麻与橡胶树的亲缘关系较近且拥有较多的同源相似蛋白。
2.5 蓖麻RcZF-HD家族基因启动子元件分析
通过Plant CARE数据库分析启动子区域中的顺式调控元件，以探索RcZF-HD基因的调控机制。如图6所示，共预测到460个具有功能注释的顺式作用元件。RcZF-HD拥有多个与逆境胁迫响应、防御反应和应激反应等相关的顺式作用元件。RcZF-HD11基因启动子顺式作用元件数量最多，RcZF-HD10基因启动子顺式作用元件数量最少。这些顺式作用元件中均含有光响应元件且数量最多，有114个，占比40.4%；激素响应元件61个，占21.5%；胁迫响应元件有36个，占12.4%。RcZF-HD01/03/04/06/07/12/13均含有低温响应元件，表明它们可能在蓖麻的低温胁迫响应过程中发挥重要作用；RcZF-HD03/06/07/10/11均含有干旱响应元件，它们可能积极应答干旱胁迫。以上结果表明RcZF-HD基因家族的表达可能响应多种逆境胁迫，且表达受多种激素调控。
图6蓖麻RcZF-HD基因家族顺式作用元件分析
Fig.6Analysis of cis-acting elements of the RcZF-HD genes from castor
2.6 蓖麻RcZF-HD基因家族成员的表达模式分析
2.6.1 蓖麻RcZF-HD基因家族成员的组织表达模式分析
蓖麻RcZF-HD基因家族成员在植物不同组织中的表达情况（图7）表明：RcZF-HDs基因在胚乳期、种子期、叶、雄花中均有所表达，大部分RcZF-HDs基因在种子期和叶中高度表达。RcZF-HD05、RcZF-HD09可能在胚乳期起到重要调控作用，因其在胚乳表达期表达量最高。RcZF-HD01、RcZF-HD02、RcZF-HD12在种子期表达量最多。RcZF-HD04、RcZF-HD10在叶中表达量最高，可能与叶的生长发育密切相关。RcZF-HD07、RcZF-HD08、RcZF-HD13在雄花中表达量最高，可能与花的形成有关。RcZF-HD06基因表达水平无明显变化。因此，表明RcZF-HDs基因在蓖麻生长发育的各个时期都发挥重要的调节作用。
2.6.2 蓖麻RcZF-HD基因家族成员在非生物胁迫下的表达模式分析
RcZF-HDs基因胁迫表达模式分析（图8）显示，这些基因对干旱和盐胁迫的敏感程度高于低温胁迫。在干旱胁迫的0~24 h下RcZF-HD01和RcZF-HD07上调表达明显，RcZF-HD02和RcZF-HD11以及RcZF-HD13下调表达，表明这5个基因在蓖麻响应干旱胁迫中可能起重要作用。在高盐胁迫的0~24 h下RcZF-HD05上调表达，RcZF-HD02和RcZF-HD13下调表达，说明这3个基因可能有助于蓖麻适应高盐环境。低温胁迫的0~24 h下RcZF-HD06和RcZF-HD08持续上调表达，说明这2个基因极有可能在低温环境中发挥重要作用。
图7蓖麻RcZF-HDs的组织表达模式分析
Fig.7Expression analysis of RcZF-HDs in different tissues and organs of castor
图8蓖麻RcZF-HD基因在非生物胁迫下的表达
Fig.8Expression of RcZF-HD genes in castor under abiotic stress
图下方的0、12、24表示非生物胁迫时长，灰色表示未检测到。
0, 12, and 24 below the figure represent the duration of abiotic stress, and the gray color indicates no detection.
2.6.3 RcZF-HD01与RcZF-HD07基因的组织表达特性分析
采用qRT-PCR方法研究蓖麻幼苗在干旱处理下RcZF-HD01与RcZF-HD07在根、茎、子叶和真叶中的表达情况，如图9所示，RcZF-HD01与RcZF-HD07有明显的组织表达特异性，RcZF-HD01在真叶和茎中高表达，在根组织中表达量略低，表明RcZF-HD01主要在叶中起调控作用。RcZF-HD07在茎中表达量最高，在真叶与根中的表达量水平次之，且二者之间无显著差异，推测RcZF-HD07主要在蓖麻的茎中起作用。
2.6.4 蓖麻RcZF-HD01与RcZF-HD07基因的干旱胁迫表达分析
由图10可知，PEG胁迫下RcZF-HD01与RcZF-HD07基因较未处理前均显著上调表达（P＜0.05），表明RcZF-HD01与RcZF-HD07基因在蓖麻受非生物胁迫时高效表达，从而提高蓖麻对非生物胁迫的抗性。PEG胁迫下RcZF-HD01基因在叶片和根中的表达量均呈现出先增后降趋势，且均在胁迫12 h达到峰值。干旱胁迫下RcZF-HD07基因在12 h时在根中的表达量最高，24 h时在叶中的表达量最高。
图9蓖麻RcZF-HD01与RcZF-HD07基因的组织表达模式
Fig.9Tissue expression patterns of RcZF-HD01 and RcZF-HD07 genes in castor
不同小写字母代表不同组织间差异显著（P＜0.05）。
Different lowercase letters represent significant differences between different tissues (P＜0.05) .
图10蓖麻RcZF-HD01与RcZF-HD07基因在干旱胁迫下的表达分析
Fig.10Expression analysis of RcZF-HD01 and RcZF-HD07 genes in castor under drought stress
不同小写字母代表不同胁迫时长间差异显著（P＜0.05）。
Different lowercase letters represent significant differences between different stress time (P＜0.05) .
3 讨论
本研究在蓖麻中共鉴定出13个RcZF-HDs成员，成员数量与谷子[Setaria italica（L.）Beauv.]16个[23]、石榴（Punica granatum）15个[24]、马铃薯（Solanum tuberosum L.）20个[25]、茶树（Camellia sinensis）17个[26]等的数量相差不大。通过构建不同物种系统进化树分析发现，同一组的ZF-HD基因具有相似的基因结构和基序组织，说明对ZF-HD基因的进化关系和分类分析是可靠的。同时不同物种ZF-HD基因被聚类为不同分支，表明ZF-HD基因在不同物种中进化不同，具有种属特异性[27]。
研究表明，ZF-HD基因能调节植物的发育[27]。据报道，拟南芥的AtZF-HD5可调节叶片的大小[16]；白菜的大部分ZF-HD基因可调控白菜花的发育[28]；烟草[29]的NtZF-HD22与马铃薯[30]的大部分ZF-HD基因在叶片的生长发育中起重要作用。本研究中的蓖麻ZF-HD基因主要在蓖麻的种子和叶中高表达，说明ZF-HD家族成员主要调控蓖麻种子和叶的生长发育。上述研究表明ZF-HD基因广泛参与植物生长发育，且不同物种间具有组织特异性。另外，蓖麻RcZF-HD基因家族启动子预测到多种响应元件，如：激素响应元件（赤霉素元件、生长素元件、水杨酸元件等），适应温度变化的作用元件（低温响应元件等），响应物理伤害的作用元件（伤口响应元件、参与防御和压力的顺式作用元件等）。这些作用元件的相互配合和作用可能是导致基因间表达出现差异的原因，同样也可能是蓖麻能适应多样环境变化的原因。
已有研究报道发现在多种植物中ZF-HD基因家族能响应多种非生物胁迫。例如，拟南芥AtZF-HD4在干旱、盐和低温胁迫下均上调表达[19]。番茄SlZHD13在干旱和盐胁迫下上调表达[17]。在豌豆（Pisum sativum）中PsZF-HD1和PsZF-HD10基因在低温胁迫下高表达[2]。在玉米中ZmZF-HD11和ZmZF-HD12基因积极响应干旱和高盐诱导[13]。水稻OsZF-HD2基因可提高水稻的耐盐性[31]。本研究中同样存在响应非生物胁迫的基因，如：干旱胁迫下RcZF-HD01和RcZF-HD07上调表达明显，盐胁迫诱导下RcZF-HD05上调表达，低温胁迫下RcZF-HD06和RcZF-HD08上调表达。蓖麻ZF-HD基因家族成员对干旱胁迫表现出不同程度的响应，挑选出上调表达的RcZF-HD01与RcZF-HD07，对其进行qRT-PCR分析。结果发现，RcZF-HD01与RcZF-HD07均积极响应干旱胁迫，RcZF-HD01在叶中的表达量水平显著高于其他组织，在叶和根中表达量水平均显著上调表达，RcZF-HD07主要在根和茎中表达。虽然RcZF-HD01与RcZF-HD07的分子作用机制尚不清楚，但可推测RcZF-HD01和RcZF-HD07基因在干旱胁迫中发挥重要功能，可作为蓖麻抗旱研究的候选基因。
4 结论
基于全基因组数据在蓖麻中共鉴定出13个ZF-HD基因家族成员，不均匀分布在8条染色体上，均定位于细胞核上，可将蓖麻ZF-HD基因家族成员分为3个亚簇；表达模式分析表明，RcZF-HDs基因的表达具有组织特异性，在蓖麻的不同组织中均有表达，并受干旱和盐以及低温等非生物胁迫的诱导，说明RcZF-HDs基因可能在蓖麻的各发育过程和环境应激反应中发挥重要作用，RcZF-HD01和RcZF-HD07基因研究进一步证实这一观点，RcZF-HD01和RcZF-HD07基因能积极响应干旱胁迫。
图1蓖麻RcZF-HD蛋白质的磷酸化位点
Fig.1Phosphorylation sites of castor RcZF-HD proteins
图2蓖麻RcZF-HD蛋白质的三级结构
Fig.2Tertiary structure of the RcZF-HD proteins of castor
图3蓖麻RcZF-HD基因家族成员系统进化和基因结构分析
Fig.3Phylogenetic evolution and gene structure analysis of RcZF-HD genes in castor
图4蓖麻RcZF-HD基因家族在染色体上的定位分析
Fig.4Mapping analysis of RcZF-HD genes on chromosomes in castor
图5蓖麻与水稻、橡胶树、拟南芥ZF-HD基因家族成员间的聚类分析
Fig.5Cluster analysis of ZF-HD genes among R. communis, O. sativa, H. brasiliensis, and A. thaliana
图6蓖麻RcZF-HD基因家族顺式作用元件分析
Fig.6Analysis of cis-acting elements of the RcZF-HD genes from castor
图7蓖麻RcZF-HDs的组织表达模式分析
Fig.7Expression analysis of RcZF-HDs in different tissues and organs of castor
图8蓖麻RcZF-HD基因在非生物胁迫下的表达
Fig.8Expression of RcZF-HD genes in castor under abiotic stress
图9蓖麻RcZF-HD01与RcZF-HD07基因的组织表达模式
Fig.9Tissue expression patterns of RcZF-HD01 and RcZF-HD07 genes in castor
图10蓖麻RcZF-HD01与RcZF-HD07基因在干旱胁迫下的表达分析
Fig.10Expression analysis of RcZF-HD01 and RcZF-HD07 genes in castor under drought stress
表1引物序列
Table1Primer sequences
表2蓖麻RcZF-HD基因家族成员的基本信息
Table2Basic information about castor RcZF-HD gene family members
表3蓖麻RcZF-HD蛋白质的二级结构
Table3Secondary structure of the RcZF-HD proteins of castor
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