摘要
【目的】 探究不同红蓝配比光质对银杏生长、光合与黄酮醇积累及抗氧化能力的影响,筛选适宜银杏生长与黄酮积累的光质,为调控提高银杏叶药用价值提供理论依据。【方法】以2年生银杏实生苗为试材,设红蓝比例为1∶1(1R1B)、1∶3(1R3B)、1∶5(1R5B)和白光(W,对照)4种光质处理,分析处理20 d后银杏生长、光合生理、黄酮醇含量及抗氧化能力。【结果】与白光相比,不同比例红蓝光均降低了银杏叶生物量,不利于株高地径的生长,却有利于提高叶长、叶宽、叶面积及光合气体交换参数。1R5B处理可提高叶片总叶绿素含量;1R1B处理促进了叶片总生物量积累;1R3B处理下叶片叶绿素荧光参数、抗氧化能力以及类胡萝卜素和总黄酮醇含量最大。【结论】适宜比例红蓝光配比光质对银杏生长及光合特性产生明显影响,并显著提高叶黄酮醇含量与抗氧化能力,且1R3B配比光质最有利于银杏黄酮类物质积累。
Abstract
[Objective] The study aims to investigate the effects of light quality with different red and blue ratios on the growth, photosynthesis, flavonol accumulation, and antioxidant capacity of Ginkgo biloba, select the light quality suitable for the growth and flavonoid accumulation, and provide a theoretical basis for improving the medicinal value of G. biloba leaves. [Methods] Two-year-old G. biloba seedlings were used, and four light quality treatments with red and blue ratios of 1∶1 (1R1B), 1∶3 (1R3B), 1∶5 (1R5B), and white light (W, control) were set up. The growth, photosynthetic physiology, flavonol content, and antioxidant capacity of G. biloba after 20 days of treatment were analyzed. [Results] Different ratios of red and blue light reduced the biomass of G. biloba leaves, which was not conducive to the growth of plant height and ground diameter, but was conducive to the improvement of leaf length, width, and area and photosynthetic gas exchange parameters.1R5B treatment increased the total chlorophyll content of leaves. 1R1B treatment promoted the accumulation of total leaf biomass. The chlorophyll fluorescence parameters, antioxidant capacity, carotenoid, and total flavonol contents of leaves under 1R3B were the highest. [Conclusion] The appropriate proportion of red and blue light had a significant effect on the growth and photosynthetic characteristics of G. biloba, and significantly increased the content of flavonols and antioxidant capacity. 1R3B red and blue light quality was the most conducive to the accumulation of flavonoids.
Keywords
银杏(Ginkgo biloba L.)是中国重要的经济树种[1]。已有大量研究表明,银杏叶中含有丰富的黄酮类化合物,如黄酮醇类(槲皮素、山奈酚、异鼠李素)是主要的药用活性成分,具有抗氧化、增加免疫力的功效,已被广泛应用于临床胃癌、肝损伤等治疗中[2-3]。银杏叶还可作为保健品食用,生产饮料和茶饮等,银杏已在“十三五”国家重点基础研发计划中被列为主要工业原料树种之一[4]。目前,银杏叶药用价值得到了全球科研人员的关注,其应用价值不断被挖掘,发展叶用银杏成为中国银杏产业的主要发展方向之一。
光不仅是植物获取能量的直接源泉,更是对植物生长发育起重要作用的环境因素[5]。研究表明,不同波长的光对植物的光合作用、基因表达与物质代谢影响不同[6]。目前,红蓝光质在蔬菜、药用植物栽培中的应用日益广泛。据报道,蓝光有利于银杏黄酮类化合物积累及抗氧化能力的提高,但不利于生物量的积累[7];蓝光抑制苹果幼苗生长和叶片伸长,提高光合效率,促进类黄酮代谢,而红光促进植株生长和根系发育,诱导激素传导[7]。也有研究表明,植物长时间处于单色光照射下往往会受到不良影响,组合光通常可解决此类问题,对植物的生长更有利[8]。高勇等[9]发现,适宜比例红蓝光可以提高紫叶生菜(Lactuca sativa L.)光合效能并增加类黄酮等次生代谢物的积累;Marchant等[10]研究发现红蓝复合光照射草本植物姜黄(Curcuma longa L.)能够促进姜黄素的合成,提高多酚、黄酮的积累。
迄今,已有研究表明,蓝光可显著提高银杏苗高并有利于光合色素的积累,且显著提高银杏黄酮含量及总还原力,红光则起相反作用[11],但不同比例红蓝复合光对银杏幼苗生长生理、类黄酮代谢调节机理的研究较少。为此,本研究采用LED光源,设置不同红蓝比例光质,探究不同比例红蓝光照射下叶用银杏幼苗生长、光合特性、黄酮化合物含量及抗氧化能力的变化规律,通过综合分析初步筛选出适合银杏生长的光质环境,为提高银杏药用价值及进行木本植物资源化培育提供参考。
1 材料和方法
1.1 试验材料
试验材料为2年生实生苗。种子于2021年9月采自南京林业大学下蜀林场15年生优良银杏单株。2022年3月播种育苗,种植于直径10.5 cm、高20 cm的无纺布育苗袋中,栽培基质由泥炭土、蛭石、珍珠岩按照1∶1∶1体积比混合而成。2023年5月中旬选择平均株高40 cm、茎粗6 mm、叶片数为13且无病虫害、生长相对一致的银杏苗在南京林业大学人工气候室进行光质试验。
1.2 试验设计
试验处理光源采用LED植物生长灯(由振安照明植物灯直销店提供),共设4个光质处理,红蓝光组合比例分别为1∶1(1R1B)、1∶3(1R3B)、1∶5(1R5B),以白光(W)为对照(图1)。每个处理30株银杏苗,重复 3次。不同光质配比通过红、蓝光灯珠数量组合来实现,其中,蓝光波长460~465 nm,红光波长660~665 nm。通过调整光源与植株之间的距离,保证光强维持在(250±10)μmol/(m2·s),光周期为12 h/d,采用定时器控制。用OHSP-350UV光谱仪(杭州虹谱光色科技有限公司)测定各处理LED光谱图(图2)。
试验处理苗木置于植物培养平台上,不同处理之间用内面反光布进行3面遮光,避免外部光照干扰。气候室温度为20~25℃,相对湿度为80%。试验期间,每隔3~5 d浇1次水,并定期移动植株方向防止边缘效应。处理至20 d时测定生长与光合指标,并采样测定相关生理指标。
图1不同光质银杏苗木处理
Fig.1Treatments of G. biloba seedlings under different light quality
W为白光处理(对照),1R1B、1R3B、1R5B表示红蓝光比例分别为1∶1、1∶3、1∶5的光质处理。下同。
W is white light treatment (control) , 1R1B, 1R3B, and 1R5B stand for light quality treatments with red and blue ratios of 1∶1, 1∶3, and 1∶5, respectively. The same as below.
图2不同LED光质处理的光谱图
Fig.2Spectra of different LED light treatments
1.3 测定指标及方法
1.3.1 生长指标
在光质处理开始及处理20 d时分别用卷尺测量苗高、游标卡尺测量地径,并计算苗高、地径增量。利用直尺测量叶长、叶宽,叶面积扫描仪对叶片进行1∶1扫描,并用Photoshop软件计算叶面积。用电子天平测烘干至恒重后的叶干重与整株干重。
1.3.2 光合特性与光合色素含量
叶片光合气体交换参数使用Li-6400便携式光合仪进行活体测定。每个处理5株,每株选取苗木生长点下第3~4片完整成熟叶,并做好标记,于上午8:00-11:30测定叶片净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间二氧化碳浓度(Ci)和气孔导度(Gs),测定时设置温度为(25±1)℃,光照强度为250 μmol/(m2·s)。选择标记好的叶片,采用FMS-2便携脉冲调制式荧光仪测定叶片初始荧光(Fo)、最大荧光产量(Fm),并计算PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ潜在活性(Fv/Fo)及光化学淬灭系数qP;采用乙醇浸提法测定叶光合色素含量[12],各处理重复3次。
1.3.3 黄酮醇含量及抗氧化能力
银杏叶片总黄酮醇及其组分含量参照《中华人民共和国药典》[13]中高效液相色谱法测定,总黄酮醇含量为槲皮素、山奈酚、异鼠李素三者含量之和的2.51倍。DPPH自由基清除率参考苏西娅等[14]方法,并作适当修改,具体为:取1 mL稀释10倍后的黄酮提取液,加入2 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液,混匀后避光静置30 min,在波长517 nm处测定样品吸光值A1,用70%乙醇分别代替黄酮提取液和DPPH溶液测吸光值为A0、A2,并计算DPPH自由基清除率[1-(A1-A2)/A0]×100%。ABTS自由基清除率参照Thaipong等[15]方法测定,并稍作修改:取0.4 mL稀释10倍后的黄酮提取液,加入2.9 mL的ABTS工作液,避光反应6 min后,在734 nm下测样品吸光值为B1,以70%乙醇分别代替黄酮提取液和ABTS工作液测吸光值为B0、B2,并计算ABTS自由基清除率[1-(B1-B2)/B0]×100%。
1.4 数据分析
用Excel 2019统计数据,并用SPSS 26.0软件进行方差分析和LSD多重比较(显著性水平设为α=0.05),用主成分分析对不同处理进行综合排序,用Origin 2021软件作图。图表中数据为平均值±标准差。
2 结果与分析
2.1 不同比例红蓝光对银杏生长的影响
由表1可知,银杏苗高和地径增长量在不同光质处理下均存在显著差异(P<0.05),均以白光对照(W)增量最大,各红蓝光配比光质处理均比W处理不同程度降低,但仅1R5B处理的苗高增量和1R3B的地径增量降幅达到显著水平(P<0.05),其余红蓝光质处理均与W无显著差异。叶片形态在不同光质处理间也存在显著差异(P<0.05)。叶长、叶宽、叶面积均表现为1R5B处理最大,并均显著高于W处理,而其余红蓝光质处理均与W处理无显著差异。3个红蓝光质处理银杏叶片生物量均比W处理不同程度降低,但仅1R5B处理降幅达到显著水平,显著低于W处理的38.93%。银杏植株总生物量在不同光质处理下也存在显著差异(P<0.05),并以1R1B处理最大(21.73 g),且显著高于1R5B和W处理,而1R5B和1R3B处理均与W处理无显著差异。
2.2 不同比例红蓝光对银杏叶片光合气体交换参数的影响
图3表明,不同比例红蓝光处理银杏叶片净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)和胞间CO2浓度(Ci)均高于W处理,且除1R3B处理Ci外差异均达显著水平。在3个比例红蓝光处理组间比较,银杏叶片Pn以1R3B处理最高,比W处理显著提高37.0%,也显著高于1R5B处理(P<0.05);银杏叶片Tr以1R1B处理最高,并与1R5B、1R3B、W处理均存在显著差异(P<0.05),比W处理显著增加了76.6%。银杏叶片Gs的表现为1R1B、1R5B处理显著高于1R3B处理,而前两者之间无显著差异,分别比W处理显著增加54.7%和50.9%。银杏叶片Ci 在1R5B处理下最高,并与1R3B、W处理差异显著,比W处理显著增加26.1%(P<0.05)。
表1不同比例红蓝光下银杏幼苗生长状况
Table1Growth of G. biloba seedlings under different ratios of red and blue light
注:同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences between treatments at 0.05 level (P<0.05) . The same as below.
图3不同比例红蓝光处理下银杏叶片光合气体交换参数
Fig.3The photosynthetic gas exchange parameters of G. biloba leaves under different ratios of red and blue light treatments
不同小写字母表示处理间在0.05水平差异显著(P<0.05)。下同。
Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at 0.05 level (P<0.05) . The same as below.
2.3 不同比例红蓝光对银杏叶片叶绿素荧光参数的影响
由表2可知,银杏幼苗叶片的最大荧光产量(Fm)和光化学淬灭系数(qP)在4种光质处理间均无显著差异,但均表现为1R3B>1R5B>1R1B>W。银杏叶片PS Ⅱ最大光化学效率(Fv/Fm)和PS Ⅱ潜在活性(Fv/Fo)都不同程度高于W处理,且在1R3B和1R5B处理下增幅均达到显著水平,Fv/Fm增幅分别为5.5%和4.8%,Fv/Fo增幅分别为34.6%和28.7%,1R3B处理略高1R5B处理。其中,各处理Fv/Fm基本维持在0.8左右,qP也保持稳定,表明研究范围内不同比例红蓝光照射没有破坏银杏叶片正常的光合机制。
2.4 不同比例红蓝光对银杏叶片光合色素含量的影响
由表3可知,银杏叶片叶绿素a、b及总叶绿素含量在1R3B、1R5B处理下均显著高于相应1R1B和W处理(P<0.05),而1R3B与1R5B之间,1R1B处理与W处理之间均无显著差异,其中的总叶绿素含量在1R3B、1R5B处理下分别比W处理显著上升27.2%、29.6%;银杏叶片类胡萝卜素含量在1R3B和1R5B处理下也显著高于1R1B和W处理,而1R3B又显著高于1R5B处理,1R1B处理与W处理之间无显著差异,1R3B和1R5B处理分别显著高于W处理15.79%和7.89%(P<0.05)。可见,银杏叶片类胡萝卜素含量在蓝光比例增加时先增加后减小,在1R3B处理下达到最高,而其总叶绿素含量随着蓝光比例的增加而升高。
2.5 不同比例红蓝光对银杏叶黄酮醇类含量的影响
银杏叶片槲皮素、山奈酚、异鼠李素和总黄酮醇含量在不同红蓝光质处理下均不同程度地高于W处理,且在1R3B和1R5B处理下增幅均达到显著水平,1R1B处理的槲皮素和总黄酮醇含量增幅也达到了显著水平(图4)。其中,银杏叶片槲皮素含量以1R3B处理最高(1.85 mg/g)且显著高于其余处理,其次是1R5B、1R1B,三者分别比W处理显著提高了71%, 52%, 49%,而1R5B与1R1B处理之间无显著差异;山奈酚和异鼠李素含量均以1R3B和 1R5B处理显著较高(P<0.05),1R1B、W处理较低,前两者显著高于后两者,但前两者之间及后两者之间均无显著差异;总黄酮醇含量在各比例红蓝光处理下均比W处理显著提高,并以1R3B处理最高(15 mg/g),1R1B、1R3B、1R5B处理分别比W处理(11.31 mg/g)显著提高了14%, 33%, 31%(P<0.05),而1R1B与1R5B处理间无显著差异。
表2不同比例红蓝光处理下银杏叶片叶绿素荧光参数
Table2The chlorophyll fluorescence parameters in leaves of G. biloba seedlings under different ratios of red and blue light treatments
表3不同比例红蓝光处理下银杏叶片光合色素含量
Table3The photosynthetic pigment content in leaves of G. biloba seedlings under different ratios of red and blue light treatments
图4不同比例红蓝光处理下银杏叶黄酮醇含量
Fig.4The flavonol content in leaves of G. biloba under treatments with different ratios of red and blue light
2.6 不同比例红蓝光对银杏叶黄酮类提取物抗氧化能力的影响
DPPH自由基清除率是体现体外抗氧化能力的方法之一,在一定浓度范围内,其值越大说明样品的抗氧化能力越强。由表4可知,不同比例红蓝光处理均提高了银杏叶片的抗氧化能力,其中在1R3B下银杏叶片黄酮类提取物的DPPH自由基清除率最大,相比W处理提高了20.17%,且显著高于其他光质处理(P<0.05)。ABTS自由基清除率与DPPH自由基清除率在各光质处理下表现出相似的规律,即为1R3B>1R1B>1R5B>W,其值在1R3B处理下最大(68.06%),且显著高于其他光质处理(P<0.05),此时对自由基清除效果最佳,而其余处理间均无显著差异。
表4不同比例红蓝光对银杏叶黄酮类提取物抗氧化能力的影响
Table4The effects of different ratios of red and blue light on antioxidant capacity of flavonoid extracts from G. biloba leaves
因此,从DPPH和ABTS自由基清除率随各光质处理的变化趋势可以看出,光质中随蓝光比例的增大,银杏叶片黄酮类提取物的抗氧化能力先增大后减小,并以1R3B处理最强。
2.7 不同光质对银杏叶用价值影响的主成分分析与综合评价
银杏作为重要的药用植物,其研究培育的最终目的是获取更多的药用价值。银杏叶面积、叶生物量、光合特性、药用物质含量及抗氧化能力是评价叶用银杏药用价值的重要依据。根据研究目的与培育目标,将叶面积、叶生物量、净光合速率、PSⅡ最大光化学效率、类胡萝卜素含量、总叶绿素含量、总黄酮醇含量、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率9个指标作为此次试验的核心指标进行主成分分析。依据特征值大于1的原则,共提取了2个主成分,其累计贡献率达84.803%(表5)。其中,第1主成分包括净光合速率、PSⅡ最大光化学效率、类胡萝卜素含量、总叶绿素含量、总黄酮醇含量及DPPH、ABTS自由基清除率,主要反映银杏叶光合生理特性;决定第2主成分的是叶面积和叶生物量,反映了银杏叶生长表型与生物量状况。根据提取的主成分得分值代入综合得分公式(F=0.627F1+0.221F2),计算出每个光质处理的综合得分,并由大到小排序,结果如表6所示。4个光质处理排名由高到低依次为1R3B、1R5B、1R1B、W。
表5不同比例红蓝光处理下9个核心指标的主成分分析
Table5Principal component analysis of nine core indicators under different ratios of red and blue light treatments
表6不同比例红蓝光处理的主成分综合得分及排名
Table6Composite scores and rankings of principal components of different ratios of red and blue light treatments
3 讨论
光质影响植物组织与器官的发育速度,对植株形态特征产生调控作用[16]。本次试验结果表明,不同比例红蓝光质下银杏植株的苗高、地径都有所减小,这与Zhang等[7]的研究结果相似。林婧[17] 发现,樱桃番茄幼苗在不同LED红蓝组合光照处理后,随着光质中蓝光比例增大,株高逐渐降低。在本试验中,随着蓝光占比增加,银杏苗高增长量也表现出逐渐降低趋势,这与上述研究结果一致。同时,银杏叶片形态也会受到光质的影响,红蓝组合光质下银杏的叶长、叶宽、叶面积均高于白光处理,这与张文林等[18]研究结果相似。对于光质对植物生物量积累的影响方面,刘敏竹等[19]发现,在不同比例红蓝光及单色红、蓝光下,红桔幼苗叶生物量有所下降;而在红蓝组合光下,红光占比越高越有利于山白兰苗木生物量累积[20]。本试验结果均与这些前人研究结果相符。
光质对植物叶片光合参数的影响会因光照环境条件、试验材料的不同而有所差别[21]。相关研究显示,不同比例红蓝光均导致‘金秋’砂糖橘新梢叶片Pn提高,且对于不同物种的最适红蓝比例存在显著差异[22]。在本试验中,不同比例红蓝光均能提高银杏幼苗叶片Pn、Tr和Gs,且在1R3B处理下Pn最大;同时,Gs的变化规律与Tr相似,都以1R1B处理下最高,说明1R1B光质处理促进了银杏叶片的气孔开放,从而提高了蒸腾速率,这与王丽伟等[23]研究结果一致。另外,银杏叶片Pn与Gs、Ci的变化趋势不完全相同,这意味着本试验中光合速率的变化不是气孔因素所致,而是由非气孔因素造成的[24]。叶绿素荧光参数能够反映植物叶片在不同环境中对光能的吸收、传递、耗散比例及分配等情况[25]。孙雨[26]对生菜进行不同比例红蓝光处理发现,Fv/Fm、Fv/Fo、qP变化趋势相同,且白光照射下的值均低于红蓝组合光处理。本试验中银杏叶片Fv/Fm、Fv/Fo、qP在4种光质处理下也均表现为1R3B>1R5B>1R1B>W的相同趋势,与上述研究结果一致。同时,本研究还发现,红蓝光质中随蓝光占比的增加,银杏叶片Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、qP值均呈先增加后减小的趋势,并均在1R3B处理时最大,此时净光合速率也表现为最大,光合活性最高,这在一定程度上说明了光合作用与叶绿素荧光参数的相关关系[27]。光合色素不仅能将吸收的光能转化为化学能,为植物生长提高能量,同时其组成与含量对叶片光合速率也有显著影响,进而影响整个植株的生长状况[28]。本研究发现,LED红蓝复合光质中蓝光比例越高,银杏叶片叶绿素含量越高,这一点与李坤等[29]的研究结果相吻合。同时有研究表明,不同比例红蓝光质对红叶石楠试管苗叶绿素合成有促进作用[30],这也与本研究结果相同。
光质作为一种特殊信号分子,是影响植物次生代谢过程的重要因素。次生代谢物质在植物体内的合成和积累与光质调控密切相关[31]。本试验结果显示,不同比例红蓝混合光处理对银杏叶黄酮类物质积累均有促进作用,且总黄酮醇含量显著高于对照。姜宗庆[32]也发现红蓝混合光处理对香椿芽苗菜中抗氧化物质含量有明显促进效果。同时,本研究发现,在红蓝组合光质中,随着蓝光比例的增加,银杏叶总黄酮醇含量先增加后减少,并在1R3B处理时最高,这与郭阿瑾等[33]的研究结果表现一致,但与吕铮[34]的结果存在一定差异。这一方面可能是不同物种间差异所致,另一方面也可能是试验处理光强及其他试验条件不同所致。植物体内的黄酮类化合物具有较好的抗氧化活性,对DPPH、ABTS等自由基具有较强的清除效果[35]。本试验中各处理黄酮类化合物对DPPH和ABTS自由基清除效果均以1R3B处理最佳,原因可能是1R3B光质处理更有利于诱导银杏叶黄酮类物质合成途径中关键基因的上调,促进黄酮类物质积累,从而引起抗氧化能力增强[36]。同时,DPPH和ABTS自由基清除率与银杏叶片总黄酮醇含量变化趋势相似,这与唐丽等[37]的研究结果相符,表明不同红蓝混合光处理增加了黄酮含量且提高了银杏叶的抗氧化能力。
4 结论
不同比例红蓝光质均对银杏幼苗的生长、光合、黄酮醇含量及抗氧化能力产生不同程度影响。白光对银杏植株形态的影响较为显著且有助于叶生物量的增加;叶片形态在1R5B处理下变化最为明显。1R3B处理不仅提高了银杏叶片的光合效率和叶绿素含量,还显著促进黄酮类物质的积累及抗氧化能力的增强。综合分析表明,1R1B、1R3B和1R5B处理对银杏叶用价值影响都优于W处理,其中1R3B处理最有利于银杏黄酮醇含量的积累和药用价值的提高。